3.1. Chuẩn bị cho phép thử
Nồng ựộ chất thử ựược biểu diễn bằng khối lượng chất thử trên khối lượng của chất nền (mg/kg)
3.1.1. Chuẩn bị chất gây nhiễm
a. Các chất tan trong nước
Ngay trước khi bắt ựầu phép thử, hòa tan một lượng chất thử cần thiết ựể tạo một nồng ựộ trong nước (hoặc lượng cần thiết ựể làm ẩm ựất ựể ựạt ựược những yêu cầu của 3.2) và trộn kỹ với chất nền (3.2) ựã nói trên trước khi ựưa vào chau thủy tinh.
b. Các chất không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ
Hòa tan một lượng chất thử cần thiết ựể thu ựược nồng ựộ mong muốn trong dung môi bay hơi (như là axeton hoặc hexan).
Cho chất thử vào chậu thủy tinh ựã có chất nền. Trộn cẩn thận và làm bay hơi dung môi bằng cách ựặt chậu thủy tinh vào tủ hút. Sau ựó thêm nước theo 3.2. Trộn cẩn thận và tiếp tục như mô tả 4.1.2.
Chú ý: Cần phải cẩn thận khi tiếp xúc với hơi dung môi ựể tránh nguy hiểm do bị hắt phải hoặc do nổ và tránh thiệt hại cho thiết bị chiết, bơmẦ
c. Các chất không tan trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ
đối với chất không tan trong dung môi hữu cơ thì ựiều chế một hỗn hợp gồm 10g cát thạch anh (xem 3.2) ựã ựược nghiền nhỏ và một lượng cần thiết chất thử ựể thu ựược nồng ựộ mong muốn. Trộn kỹ và tiếp tục như trình bày 4.1.2.
3.1.2 Giới thiệu sinh vật khảo sát
Xác ựịnh hàm lượng nước và pH của ựất nhân tạo ở ựầu và cuối phép thử (khi chất thử là axit hoặc bazơ thì không cần ựiều chỉnh pH).
Lấy 10 con giun ựất ựã ựược chuẩn bị như trong 3.1 thấm khô chúng bằng giấy hút nước, cân va cho chúng vào chậu chứa mẫu thử.
Che chậu chứa mẫu thử và ựặt nó vào mảnh ựất thử có rào xung quanh (xem 3.4). 3.1.3 Chậu ựối chứng
Chuẩn bị chậu ựối chứng giống như ựối với chậu thử. Nếu qúa trình thử ựòi hỏi dùng dung môi (xem 4.1.1 b) thì cần chuan bị chậu ựối chứng có dung môi nhưng không có chất thử.
3.2. Thử sơ bộ (thử nghiệm thăm dò)
Thực hiện phép thử sơ bộ vớI nồng ựộ chất thử khác nhau (vắ dụ: 0,1mg/ kg; 1mg/kg; 10g/kg; 100mg/kg và 1000mg/kg). Các nồng ựộ ựược biểu diễn bằng miligam chất thử trên kilogam chất nền khô (3.2) và mỗi phép kiểm tra dùng 10 con giun ựất cho mỗi nồng ựộ và mỗi chậu thử.
Chuẩn bị chậu thử và môi trường gây nhiễm như ở phần hướng dẫn ở trên.
Sau 7 ngày ựếm những con giun còn sống và lấy ra những con giun chết nếu nhìn thấy.
Sau 14 ngày ựếm những con giun còn sống và những con giun chết trong chậu (một con giun ựược coi là chết nếu nó không có phản ứng khi bị gim châm từ phắa trước)
Tắnh phần trăm tử vong ựối với mỗi chậu chứa và ở mỗi nồng ựộ. Ghi chép các trieu chứng quan sát thấy trên giun.
3.3. Phép thử cuối cùng (thử nghiệm chắnh thức)
Dựa trên kết quả của phép thử sơ bộ, thực hiện phép thử cuối cùng ở 5 nồng ựộ chất thử theo cấp số nhân giữa nồng ựộ cao nhất không gây tử vong và nồng ựộ thấp nhất gây tử vong hoàn toàn.
đồng thời lặp lại 4 mẫu theo mỗi nồng ựộ và một phép kiểm tra không có chất thử (mẫu ựối chứng) và nếu cần thiết, một phép kiểm tra khác có dung môi. đặt mỗi chậu chứa mẫu vào môi trường thử. Trong thời gian thử và sau 14 ngày thực hiện như chỉ dẫn trong 4.2.
Khi kết thúc phép thử, xác ựịnh tổng số và hối lượng giun sống trong mỗi chậu kiểm tra, giá trị pH trong một chậu về nồng ựộ thử.
Lưu ý: với chất thử chuẩn cloaxetamit thì LC50 cần phải ở trong khoảng gữa 20mg/ kg và 80mg/ kg.
4. TÍNH TOÁN VÀ THỂ HIỆN KẾT QỦA 4.1 Tắnh toán 4.1 Tắnh toán
Xác ựịnh phần trăm tử vong thu ựược từ phép thử cuối cùng ựối với nồng ựộ.
Ghi chú: Khi số liệu ựầy ựủ thì gắa trị LC 50 Ờ 14d (14 ngày) và ựộ tin cậy (T = 0,95) ựược xác ựịnh bằng cách sử dụng các phương pháp tiêu chuẩn (Litch field and Wilcoxon hoặc các phương pháp tương ựương).
Khi hai nồng ựộ liên tiếp ở tỉ lệ bé hơn hoặc bằng 1,8 (vắ dụ: 10:18) chỉ cho duy nhất 0% và 100% tử vong thì hai giá này là ựủ ựể chỉ khoảng trong ựó LC50. 4.2 Thể hiện kết qủa
Kết qủa ựược tắnh bằng miligam trên kilogam chất nền khô, ựại lượng LC50 Ờ 14d (hoặc lâu hơn nếu phép thử ựược kéo dài hơn qui trình này, nồng ựộ cao nhất gây tử vong 0% và nồng ựộ thử thấp nhất gây tử vong 100%.