Sau khi phân lập được những chủng vi khuẩn S. suis, chúng tôi tiến hành làm phản ứng PCR phức hợp (Multiplex PCR) định type huyết thanh cho các mẫu này với các cặp mồi đặc hiệu cho serotype 1, 2, 7 và 9. Vì đây là các S. suis serotype hay gặp gây bệnh ở lợn, đặc biệt là serotyp 2 có thể gây bệnh cho người. Kết quả định type huyết thanh cho các mẫu được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả định type huyết thanh cho các chủng vi khuẩn S.suis phân lập được
Typ huyết thanh Số mẫu dương tính / Số mẫu kiểm tra
Tỷ lệ (%)
Các chủng phân lập từ dịch họng
Typ 1 0 / 22 0,00 Typ 2 1 / 22 4,54 Typ 7 1 / 22 4,54 Typ 9 1 / 22 4,54 (-) M1 M1 M2 M2 M2 L (+) M3 M3
Hình 4.3. Sản phẩm phản ứng PCR S. suis serotype 7 sau quá trình điện di
Ghi chú:
(-): đối chứng âm; (+): đối chứng dương L: ladder; M1: mẫu 1; M2: mẫu 2; M3: mẫu3 Mẫu 3 dương tính với S. suis serotyp7 (379bp)
Qua bảng 4.4 cho thấy, 22 chủng S.suis phân lập được từ dịch họng lợn đã xác định được 1 chủng thuộc serotype 2, 1 chủng thuộc serotype 7, 1 chủng thuộc serotype 9, không xác định được chủng nào thuộc serotype 1.
S.suis serotype 2 từ lâu, đã được thông báo là serotyp thường gặp nhất gây bệnh cho lợn và người ở hầu hết các nước trên thế giới (Lun và cộng sự, 2007, Vasconcelos và cộng sự, 1994). Ở Anh, bệnh do serotyp 2 gây ra chủ yếu là gây bại huyết và viêm não ở lợn đã cai sữa (Windsor và Elliott, 1975). Ở Hà lan, S. suis serotyp 2 là nguyên nhân chính gây viêm phổi (42%), viêm não (18%), viêm nội tâm mạc (18%) và viêm đa thanh mạc (10%) (Vecht và cộng sự, 1985. Theo kết quả điều tra của một số nhà nghiên cứu nước ngoài trên đàn lợn ở Hà Lan thì 32% số lợn kiểm tra có vi khuẩn S. suis serotyp2 ở hạch Amidan (Arends và cs, 1984), tại Pháp là 40% (Marois,2006). Ngoài serotyp 2,
S. suis thuộc các serotyp khác cũng đã phân lập được từ lợn bị viêm phổi- màng phổi ở Đan Mạch (Perch và cộng sự, 1983), Hà lan (Vecht và cộng sự, 1985), Bỉ (Hommez và cộng sự, 1986), Phần Lan (Sihvonen và cộng sự, 1988). Australia
(Gogolewski và cộng sự, 1990), Canada (Higgins và cộng sự 1990, Gottschalk và cộng sự, 1991a, 1991b) và Mỹ (Reams và cộng sự, 1994).
Vi khuẩn S. suis serotyp 2 cũng phân lập được từ lợn khoẻ mạnh bình thường nhưng với tỷ lệ thấp. Clifton-Hadley và cộng sự (1984) khi tiến hành điều tra tỷ lệ mang trùng ở 4 đàn lợn khoẻ mạnh ở Anh, cho thấy 2 đàn mang serotyp 2 với tỷ lệ lần lượt là 1,5% và 20%. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu khác được tiến hành tại Canada: nghiên cứu của Brisebois và cộng sự (1990) cho kết quả là serotyp 2 có trong 12% đàn lợn không có triệu chứng lâm sàng và trong 4% số lợn của các đàn này; còn Monter Flores và cộng sự (1993) đã phân lập được serotyp 2 ở 8/19 đàn lợn khoẻ mạnh, trong đó serotyp 2 có trong xoang mũi của 1,5% số lợn, còn serotyp 19 là 24% và serotyp 21 là 19%.
Trong năm 2007, TTCĐTYTW đã phân lập được 19 vi khuẩn S.suis từ 65 mẫu bệnh phẩm và dịch họng trong đó S. suis týp 2 phân lập được từ Sóc Sơn và Huế. Theo báo cáo của Viện Thú y (tháng 7/2007), trong 22 mẫu bệnh phẩm phân lập được S. suis thì có 8 mẫu có S. suis týp 2. Kết quả theo dõi giám sát dịch bệnh của Cục thú y và nghiên cứu của Viện thú y chưa xác nhận được các ổ dịch do S. suis gây ra.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã xác định được 1 chủng thuộc typ2 trong tổng số 22 mẫu dịch họng dương tính với S. suis của lợn khỏe mạnh, chiếm 4,54%. Kết quả này cao hơn so với kết quả nghiên cứu của TTCĐTYTW năm 2008 ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam (trong tổng số 133 mẫu dịch họng của lợn khỏe dương tính với S. suis, đã xác định được 1 chủng
S. suis serotyp 2, chiếm tỉ lệ 0,75%).
Các chủng thuộc S. suis typ 2 thường gây ra bệnh cho lợn giai đoạn sau cai sữa và vỗ béo (4-16 tuần tuổi) với rất nhiều thể bệnh như viêm não, viêm nội tâm mạc, ngoại tâm mạc, cơ tim hoại tử, viêm phổi, viêm khớp và bại huyết (Gogolewski và cộng sự, 1990, Sanford và cộng sự, 1987a, 1987b, St.
John và cộng sự, 1982, Vetcht và cộng sự, 1985). Bệnh thường xảy ra sau khi lợn khoẻ được nuôi hoặc nhốt chung với lợn bệnh và thường gây chết đột ngột với các biểu hiện như sốt, có triệu chứng thần kinh, viêm khớp.
Những nghiên cứu về dịch tễ học cho thấy S. suis typ 2 có thể lây từ đàn này sang đàn khác do sự di chuyển của một số cá thể nào đó trong đàn. Ngay trong cùng một đàn, sự lây lan chủ yếu là do tiếp xúc giữa các cá thể với nhau hoặc với chất thải nhiễm vi khuẩn. Ngoài ra, các vật chủ trung gian cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền lây S. suis. Enright và cộng sự (1987) đã chứng minh được rằng ruồi có thể mang S. suis typ 2 trong vòng ít nhất là 5 ngày và có thể gây nhiễm thức ăn và nguyên liệu mà chúng đậu vào trong vòng ít nhất là 4 ngày. Bởi vậy, chính ruồi đóng vai trò quan trọng trong việc làm lây lan bệnh giữa các cá thể trong cùng một đàn và giữa các đàn. Vai trò của các loài động vật khác và kể cả chim như là nguồn lây nhiễm vẫn còn đang được tiến hành nghiên cứu. Chính con người cũng có thể là nguồn mang trùng (Sala và cộng sự, 1989).
Vì vậy S. suis serotyp2 là serotyp rất nguy hiểm, phương thức lây truyền rất phức tạp, có thể gây bệnh cho người. Vào năm 2005, ở Trung Quốc xuất hiện ổ dịch liên cầu khuẩn ở lợn, 644 lợn và 208 người mắc bệnh do S. suis
serotyp 2 làm 39 người tử vong (Huang và cs, 2005). Gần đây, các nghiên cứu của Trung Quốc đã thông báo rằng chủng S. suis serotyp 2 gây bệnh ở lợn và người tại nước này đã có biến đổi lớn về gene và yếu tố độc lực mới được phát hiện. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuy S. suis serotyp 2 chiếm tỷ lệ thấp (4,54%) nhưng nguy cơ lây nhiễm bệnh sang người ở những huyện tiến hành điều tra là rất đáng lo ngại. Bởi vì, những huyện này có mật độ dân số cao (từ 300 – 800 người/km), ngành chăn nuôi lợn phát triển, chăn nuôi nhỏ lẻ khó quản lý vệ sinh giết mổ và vệ sinh an toàn thực phẩm làm nguy cơ lây truyền vi khuẩn Streptococus suis từ những con lợn khỏe sang người là khá cao.
Ngoài S. suis serotyp 2, các chủng S. suis thuộc các serotyp khác (không phải serotyp 2) cũng được phân lập, giám định từ lợn bị viêm phổi - màng phổi tại Đan Mạch (Perch và cộng sự, 1983), Hà Lan (Vecht và cộng sự, 1985), Bỉ (Hommez và cộng sự, 1986), Phần Lan (Sihvonen và cộng sự, 1988), Australia (Gogolewski và cộng sự, 1990), Canada (Higgins và cộng sự, 1990, Gottschalk và cộng sự (1991a, 1991b và Mỹ (Reams và cộng sự, 1994). Các tác giả cũng đã nhận xét rằng sự phân bố của các bệnh tích ở lợn bệnh là hoàn toàn khác so với bệnh do serotyp 2 gây ra. Như vậy, nhiều khả năng là một vài serotyp nhất định có các đặc điểm độc lực và đặc tính gây bệnh riêng. Chính điều này đã giải thích cho các trường hợp viêm phổi rất nghiêm trọng do serotyp 3 gây nên ở Achentina (Vena và cộng sự, 1991) hoặc là hiện tượng lây lan bệnh của serotyp 14 ở Anh (Heath và cộng sự, 1996) và chính serotyp này cũng đã gây ra 1 ca bệnh ở người (Gottschalk và cộng sự, 1989).
Trong số những S. suis serotyp gây bệnh ở lợn nổi lên là các serotyp 1, serotyp 7 và serotyp 9. Vi khuẩn S. suis typ 1 thường gây bệnh cho lợn còn đang theo mẹ (1-3 tuần tuổi), có khi tới 6 tuần tuổi và thường ở thể bại huyết hoặc các nhiễm trùng tại chỗ như viêm màng não, viêm não, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, đặc biệt là lợn con từ 1-7 ngày tuổi (Cook và cộng sự, 1988). Lợn con bị nhiễm bệnh là do lợn mẹ truyền qua đường hô hấp, đường tiêu hoá (do tiếp xúc với phân, các chất thải hoặc các chất tiết khác), đường máu (do tiếp xúc trực tiếp hoặc qua kim tiêm nhiễm trùng). Với một số cá thể, hiện tượng nhiễm khuẩn chỉ biểu hiện ở dạng nhiễm khuẩn qua máu và không bao giờ phát bệnh. Tuy nhiên, với một số cá thể khác, vi khuẩn sẽ gây bệnh và biểu hiện bằng hiện tượng nhiễm trùng máu hoặc vi khuẩn di chuyển đến hệ thần kinh trung ương, gây viêm màng não và đây chính là biểu hiện bệnh lý quan trọng nhất. Gần đây, trong một ổ dịch do S. suis serotyp 9 gây ra tại Canada, Vasconcelos và cộng sự (1994) đã quan sát và thấy rằng 100% lợn
chết có biểu hiện viêm khớp, 91% có viêm não, 73% có viêm phổi kẽ, 42% có viêm nội tâm mạc.
Trong khuôn khổ của đề tài này, ngoài định týp S. suis serotyp2, chúng tôi đã tiến hành định týp cho 3 serotyp quan trọng này. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã xác định được 1 chủng thuộc týp 7 trong tổng số 22 mẫu dịch họng của lợn khỏe mạnh, chiếm 4,54% và 1 chủng thuộc tysp 9 (4,54%); không định được týp 1 nào.
Kết quả giám định này thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của TTCĐTYTW năm 2008 ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam về xác định typ 1 và typ 9 cho các mẫu dương tính với S. suis phân lập được từ dịch họng lợn khỏe. Theo nghiên cứu này, trong tổng số 133 mẫu dịch họng lợn khỏe dương tính với S. suis, đã định typ được 12 chủng thuộc serotyp 1(chiếm 9,02%), xác định được 11 chủng thuộc serotyp 9 (chiếm 8,27%). Riêng xác định serotyp 7 phù hợp với nghiên cứu của TTCĐTYTW (trong tổng số 133 mẫu dương tính với S. suis phân lập được từ dịch họng lợn khỏe, xác định được 6 chủng thuộc serotyp 7, chiếm tỷ lệ 4,51%).
S. suis serotype 1, 2, 7, 9 là những serotype phổ biến gây bệnh liên cầu khuẩn trên lợn, đặc biệt là serotyp 2 là serotyp quan trọng nhất, nguy hiểm nhất, làm lây nhiễm bệnh giữa lợn và người.Vậy mà, chỉ với 22 chủng S. suis
phân lập được từ trong đề tài này chúng tôi cũng đã xác định được 1 chủng thuộc serotype 2, 1 chủng thuộc serotype 7, 1 chủng thuộc serotype 9. Điều này đặt ra mối quan tâm cho những người làm công tác thú y vì không chỉ lợn ốm có vi khuẩn S. suis, mà cả những lợn khỏe mạnh cũng có thể mang vi khuẩn S. suis serotype 1, 2, 7, 9. Những lợn này sẽ trở thành nguồn lây lan mầm bệnh vì chúng thường xuyên thải mầm bệnh ra môi trường, đặc biệt
S. suis serotyp 2 có thể lây nhiễm gây bệnh cho người.
4.6. KẾT QUẢ KIỂM TRA MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC CỦA VI KHUẨN S. SUIS PHÂN LẬP ĐƯỢC
Sau khi giám định vi khuẩn bằng phương pháp PCR, chúng tôi kiểm tra 10 chủng S. suis (1 chủng thuộc serotyp 2, 1 chủng thuộc serotyp 7, 1 chủng thuộc serotyp 9 và 7 chủng chưa xác định serotyp) trong tổng số 22 chủng S. suis đã phân lập được bằng một số phản ứng sinh hóa.
Bảng 4.5. Kết quả xác định 1 số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn S. suis giám định được
TT Tên phản ứng Số chủng kiểm tra Số chủng dương tính Tỷ lệ %
1 Voges Proskauer 10 0 0 2 Sucroza 10 10 100 3 Mannitol 10 0 0 4 Sorbitol 10 0 0 5 Lactose 10 10 100 6 Trehalose 10 10 100 7 Inulin 10 10 100 8 Salicin 10 10 100
Qua bảng 4.5, chúng tôi nhận thấy những chủng S. suis phân lập giám định được bằng phương pháp PCR sau khi tiến hành các phản ứng sinh hóa đều có đặc tính sinh hóa đặc trưng. Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: Sucroza, Trehalose, Inulin, Lactose, Salicin; không lên men các loại đường: Sorbitol, Mannitol; phản ứng Voges Proskauer âm tính. Kết quả này phù hợp với tiêu chuẩn TCVN 8401: 2010 của phòng vi trùng- TTCĐTYTW
Hình 4.4. Phản ứng lên men đường của Streptococcus suis
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của C. Marois (2004). Nghiên cứu cho thấy kết quả PCR để phân lập giám định
S. suis hoàn toàn phù hợp với kết quả các phản ứng sinh hóa. Tuy nhiên PCR là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn để giám định, phân lập các chủng S. suis. Ngoài ra việc thực hiện các phản ứng sinh hóa dễ gây tạp khuẩn, mất nhiều thời gian, chỉ xác định được chủng vi khuẩn S. suis mà không xác định được các serotyp của vi khuẩn này. Vì vậy, hiện nay phương pháp PCR được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm để phân lập giám định, xác định các serotyp của vi khuẩn Streptococcus suis.