Các phương pháp PCR dùng để giám định vi khuẩn S. suis cũng như một số serotyp gây bệnh thông thường của vi khuẩn S. suis được thực hiện theo quy trình đã được chuẩn hoá của Phòng Vi trùng - Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.
3.4.6.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là S. suis đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu ở 370C, (5% CO2) từ 18 đến 24 giờ
Đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được giám định là S. suis hoặc sử dụng các chủng S. suis chuẩn.
3.4.6.2. Tách chiết DNA
Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hay bằng phương pháp shock nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Tách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: lấy 3 đến 4 khuẩn lạc hòa vào 100 µl nước vô trùng không chứa men Rnase và Dnase (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 phút. Ly tâm huyễn dịch 12000 g trong 4 phút. Thu hoạch phần nổi phía trên ( phần nước trong là DNA) để làm phản ứng PCR.
3.4.6.3. PCR phát hiện gene glutamate dehydrogenase (gdh) để giám định vi khuẩn S. suis
Mồi của phản ứng PCR: Cặp mồi của phản ứng được thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hoá glutamate dehydrogenase (gdh) đặc trưng cho vi khuẩn
S. suis, gồm 1 mồi xuôi là Str2-F và 1 mồi ngược là Str2-R. Trình tự các nucleotid của mồi được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh
Gen
đích Kí hiệu mồi Trình tự cặp mồi (5’ – 3’)
Kích cỡ sản phẩm(base pair - bp) gdh Str2 – F 5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’ 688 Str2 – R 5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’ Thành phần phản ứng PCR được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích cho 1 phản ứng
Multiplex PCR kit mix 2x 25 µl
PCR water 15 µl
Primer foward 2.5 µl
Primer reverse 2.5 µl
DNA 5 µl
Tổng 50 µl
Khi làm PCR phải có mẫu là đối chứng dương, đối chứng âm và mẫu kiểm tra. DNA của mẫu đối chứng dương và mẫu kiểm tra được tách chiết như đã nêu ở trên. Mẫu đối chứng âm bao gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn.
Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định gen gdh
Các giai đoạn của phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Số Chu kì
Giai đoạn tiền biến tính 94 5 1
Giai đoạn biến tính Giai đoạn bắt cặp Giai đoạn tổng hợp 94 60 72 1 1 1 35
Giai đoạn kéo dài 72 7 1
3.4.6.4. Chạy điện di
Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose1,5 - 2% trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE. Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian 30 – 50 phút, ở 100 V, sau đó nhuộm bằng dung dịch Ethidium Bromide 0,2 mg/100ml. Trong quá trình điện di cần phải có DNA chuẩn (ladder) để đối chiếu xem kích cỡ sản phẩm. Đọc kết quả và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc 2000. Ảnh được lưu giữ lại và được tiến hành xử lý kết quả khi cần thiết.
3.4.6.5. Đọc kết qua
Phản ứng đúng khi:
+ Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm. + Mẫu đối chững âm: không xuất hiện vạch.
- Mẫu kiểm tra là dương tính khi có vạch giống mẫu đối chứng dương. - Mẫu kiểm tra là âm tính khi không có vạch giống mẫu đối chứng âm.