2 .4.3 Cơ chế phõn tử của chuyển gen thụng qua A.tumefaciens
3.3. Nội dung nghiờn cứu
Nội dung 1: Xõy dựng hệ thống chuyển gen sử dụng gen gus làm chỉ thị
*Thớ nghiệm 1: Lựa chọn chủng vi khuẩn thớch hợp cho thớ nghiệm chuyển gen ở SP nguyờn cõy và callus
Trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng 5 chủng vi khuẩn sau để lựa chọn ra chủng vi khuẩn thớch hợp nhất cho chuyển gen vào bốo tấm SP nguyờn cõy và callus. CT1: AA6, CT2: EHA 105 CT3: AGL-1 CT4: LBA4404 CT5: GV3101
* Thớ nghiệm 2: Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyờn cõy và callus
Mật độ khuẩn được xỏc định bằng mỏy quang phổ khả kiến- tử ngoại của hóng Beckman & Coulter cú dải đo 550 nm – 800 nm, ở bước súng 600 nm chỳng tụi bố trớ cỏc cụng thức thớ nghiệm:
CT1: OD600 = 0,5 CT2: OD600 = 0,8 CT3: OD600 = 1,0 CT4: OD600 = 1,5
CT5: OD600 = 1,5.
*Thớ nghiệm 3: Ảnh hưởng của thời gian ly tõm chõn khụng tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyờn cõy và callus SP
Trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng cỏc mức thời gian ly tõm chõn khụng sau:
CT1: 5 phút CT2: 10 phút CT3: 15 phút CT4: 20 phút.
* Thớ nghiệm 4: Đỏnh giỏ ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bốo tấm SP nguyờn cõy và callus
Trong thớ nghiệm này, dải nồng độ AS được bổ sung vào mụi trường lõy nhiễm và đồng nuụi cấy như sau:
CT1: 0àM CT2: 100àM CT3: 200àM CT4: 300àM CT5: 400àM.
Nội dung 2: Chuyển gen bền vững vào callus Spirodela polyrrhiza.
+ Thực hiện 24 thớ nghiệm chuyển gen gus và hptII vào callus bốo tấm SP
+Chọn lọc và tỏi sinh cõy chuyển gen trờn mụi trường tỏi sinh cú bổ sung 10 mg/l geneticin (6-7 chu kỳ chọn lọc)’
+ Bèo sống sút sau chọn lọc đem tỏch chiết DNA và được kiểm tra bằng phương phỏp PCR .