2 .4.3 Cơ chế phõn tử của chuyển gen thụng qua A.tumefaciens
3.2. Phương phỏp nghiờn cứu
3.2.1. Xõy dựng hệ thống chuyển gen sử dụng gen gus làm chỉ thị
Bốo tấm là loài thực vật cú hoa nhỏ nhất trong giới thực vật, cú cấu trỳc cơ thể thuyờn giảm so với cỏc loài thực vật bậc cao khỏc, chỳng chỉ cú rễ và cỏnh bốo. Bốo tấm sinh sản chủ yếu bằng phương phỏp mọc cỏnh con rồi tỏch ra khỏi cỏnh mẹ. Trờn cơ sở đặc điểm này, chỳng tụi đó sử dụng bốo tấm nguyờn cõy cựng với callus của bốo tấm thu được từ quy trỡnh tỏi sinh làm nguyờn liệu để chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
Thớ nghiệm chuyển gen vào callus và bốo tấm SP nguyờn cõy được tiến hành theo cỏc bước như sau:
3.2.1.1. Chuẩn bị dịch vi khuẩn lõy nhiễm:
Huyền phù callus/bèo tấm và Agrobacterium
Chuyển callus/bèo tấm lên môi tr ờng đồng nuôi cấy
(Đồng nuôi cấy 2-3 ngày)
Agrobacterium nuôi trên LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp với từng chủng
(Nuôi ở 280C, 2 ngày)
Bổ sung AS (1 - 2h tr ớc khi biến nạp)
(Trộn đều)
Đo OD
Chuyển callus/bèo tấm lên môi tr ờng diệt khuẩn
Agrobacterium nuôi trên LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn
lọc thích hợp với từng chủng
(Nuôi qua đêm ở 280C, lắc 140 vòng/phút)
Vật liệu chuyển gen (Callus/SP nguyên cây)
(Ly tâm chân không)
Chuyển callus/bèo tấm lên môi tr ờng chọn lọc
Nhân + tái sinh callus/bèo tấm ngay sau chọn lọc
(Diệt khuẩn 2-3 đợt (5-6ngày/đợt)
(Chọn lọc 6-7đợt(5-6 ngày/đợt)
Kiểm tra dòng bèo sống sót sau chọn lọc bằng PCR Quan sát biểu hiện
Cấy vi khuẩn A. tumefaciens từ đĩa thạch sang 5 ml mụi trường LB lỏng (pH 7,2), nuụi lắc 200 vũng / phỳt, 28oC qua đờm. Chuyển 1 ml dịch vi khuẩn sang 20 ml mụi trường LB lỏng (pH 5,6), bổ sung khỏng sinh thớch hợp và nuụi lắc 200 vũng/phỳt, 28oC qua đờm.
3.2.1.2. Lõy nhiễm bốo-vi khuẩn:
Bổ sung 200 mg/l AS trước khi biến nạp 1- 2 giờ, đo OD600 dịch vi khuẩn lõy nhiễm (OD600 = 0,8-1,0). Chuyển callus / SP nguyờn cõy từ đĩa nuụi cấy đặc sang dịch vi khuẩn Agrobacterium, lõy nhiễm trong điều kiện ly tõm chõn khụng, thời gian 5 phỳt/ lần x 2 lần, sau đú giữ ở nhiệt độ phũng 10 phút.
3.2.1.3. Đồng nuụi cấy
Thời gian đồng nuụi cấy vi khuẩn với bốo nguyờn cõy là 3 ngày và với callus là 2 ngày.
- Mụi trường đồng nuụi cấy bốo tấm SP nguyờn cõy với vi khuẩn là: H/2 + 10g/l sucrose + 200àM + 8,5 g/l Agar, pH=5,8.
- Mụi trường đồng nuụi cấy callus bốo tấm SP với vi khuẩn là: N6/2 + 20g/l sucrose + 1g/l CH + 200 Mà AS + 8,5 g/l Agar, pH=5,8.
3.2.1.4. Loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium sau chuyển gen.
Sau khi đồng nuụi cấy, cấy chuyển callus SP sang mụi trường diệt khuẩn N6/2 + 20g/l sucrose + 1g/l CH + 200 mg/l Timetin + 0,5 mg/l TDZ + 8,5 g/l Agar, pH=5,8; nuụi sỏng ở 26oC. Cấy chuyển và duy trỡ bốo trong mụi trường này 2-3 chu kỳ, (5-6 ngày/ chu kỳ).
Cấy chuyển callus bốo SP chuyển gen sang mụi trường N6/2 + 20g/l sucrose + 1g/l CH + 10 mg/l Geneticin + 8,5 g/l Agar, pH=5,8. Duy trỡ và cấy chuyển cỏc dũng callus đó chuyển gen trờn mụi trường chọn lọc trong 6-7 chu kỳ (5-6 ngày/chu kỳ) để thu nhận đủ số lượng bốo cho tỏch chiết ADN tổng số.
3.2.2. Quan sỏt và xỏc định tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời ở bốo tấm chuyển gen.
Sau thời gian đồng nuụi cấy, mẫu được lấy ra và nhuộm bằng dung dịch X-gluc, ủ mẫu ở 37oC qua đờm ( Jefferson, 1987). Biểu hiện tạm thời của gen
gus quan sỏt được bằng sự xuất hiện cỏc đốm hay cỏc vựng màu xanh chàm trờn cỏc cỏnh bốo hay callus bốo chuyển gen.
3.2.3.Phương phỏp tỏch chiết DNA bốo tấm.
Chỳng tụi sử dụng phương phỏp tỏch chiết DNA tổng số của ĐHTH Bonn (CHLB Đức). Callus bốo Spirodela polyrrhiza được nghiền bằng cối (giữ lạnh ở - 20 oC ) cựng với 3ml đệm chiết. Sau đú mẫu được chuyển vào ống eppendorf và thờm vào 300àl đệm SDS 20% , ủ ở 65oC trong 5 phỳt. Thờm 2ml Acetate kalium và ủ trong 2 phỳt trờn đỏ rồi ly tõm 14000 vũng/phỳt trong 5 phỳt ở 4°C. Sau khi ly tõm chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol (1:1) và ủ ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt. Ly tõm mẫu 14.000 vũng/phỳt trong 20-60 phỳt ở 4°C. Loại bỏ dịch nổi, thu và rửa tủa DNA 2 lần bằng cồn 70%. Sau đú hoà tan DNA trong đệm TE, lưu giữ ở -20oC.
Hoỏ chất tỏch chiết: Đệm chiết DNA (pH 8.0) gồm: 100mM Tris-HCL, pH 8.0; 50mM EDTA;10mM ũ-Mercaptoethanol; 20% SDS; 5 M Acetate kalium.
3.2.4.Phương phỏp phõn tớch PCR.
Xỏc định sự cú mặt của gen đó chuyển gus trong hệ gen thực vật bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi sau :
GUS-for: 5'- GCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTT-3’; GUS-rev: 5’-CCTGTAAGTGCGCTTGCTGAGTT-3’.
Kớch thước đoạn ADN được nhõn bản là 1kb. Tổng thể tớch phản ứng 20àl gồm: 5àl DNA (50ng/1àl), 2àl of dNTPs, 2 àl đệm PCR (10X), 2 àl MgCl2 (25mM), 0,6 àl primer mỗi loại (25pmol), 0,1 àl Taq polymerase, và 7,7àl H2O. Quy trỡnh chạy PCR: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phỳt; 32 chu kỳ tiếp theo: 95oC trong 1 phỳt, 64oC trong 1 phỳt, 72oC trong 2 phỳt; chu kỳ cuối 72°C trong 10 phỳt.
Điện di sản phẩm khuếch đại PCR trờn gel agarose 1%
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cho 1g agarose vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun trong lũ vi súng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50ºC rồi đổ agarose vào khay điện di đó cài sẵn lược. Sau khoảng 1 giờ, khi gel đó đụng, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X và bể để dung dịch ngập cỏch mặt gel từ 1-2mm.
- Tra mẫu DNA: Lấy mẫu chứa 1-2àl DNA pha trong 16 ul đệm TE rồi trộn 4ul đệm màu 5X và tra vào cỏc giếng nhỏ trong gel.
- Điện di sản phẩm khuếch đại trờn gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V trong khoảng 25-30 phút. DNA di chuyển từ cực õm sang cực dương. Quan sỏt sự di chuyển của màu bromophenolblue để biết khi nào cần dừng điện di.
- Nhuộm DNA bằng Ethidium brromide (EtBr): Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuụn và ngõm vào dung dịch EtBr 2 ug/ml trong thời gian khaỏng 10 phỳt trờn
mỏy lắc nhẹ. Sau đú lấy bản gel ra trỏnh nước rồi quan sỏt và chụp ảnh dưới ỏnh sỏng tia tử ngoại.
3.3. Nội dung nghiờn cứu
Nội dung 1: Xõy dựng hệ thống chuyển gen sử dụng gen gus làm chỉ thị
*Thớ nghiệm 1: Lựa chọn chủng vi khuẩn thớch hợp cho thớ nghiệm chuyển gen ở SP nguyờn cõy và callus
Trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng 5 chủng vi khuẩn sau để lựa chọn ra chủng vi khuẩn thớch hợp nhất cho chuyển gen vào bốo tấm SP nguyờn cõy và callus. CT1: AA6, CT2: EHA 105 CT3: AGL-1 CT4: LBA4404 CT5: GV3101
* Thớ nghiệm 2: Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyờn cõy và callus
Mật độ khuẩn được xỏc định bằng mỏy quang phổ khả kiến- tử ngoại của hóng Beckman & Coulter cú dải đo 550 nm – 800 nm, ở bước súng 600 nm chỳng tụi bố trớ cỏc cụng thức thớ nghiệm:
CT1: OD600 = 0,5 CT2: OD600 = 0,8 CT3: OD600 = 1,0 CT4: OD600 = 1,5
CT5: OD600 = 1,5.
*Thớ nghiệm 3: Ảnh hưởng của thời gian ly tõm chõn khụng tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyờn cõy và callus SP
Trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng cỏc mức thời gian ly tõm chõn khụng sau:
CT1: 5 phút CT2: 10 phút CT3: 15 phút CT4: 20 phút.
* Thớ nghiệm 4: Đỏnh giỏ ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bốo tấm SP nguyờn cõy và callus
Trong thớ nghiệm này, dải nồng độ AS được bổ sung vào mụi trường lõy nhiễm và đồng nuụi cấy như sau:
CT1: 0àM CT2: 100àM CT3: 200àM CT4: 300àM CT5: 400àM.
Nội dung 2: Chuyển gen bền vững vào callus Spirodela polyrrhiza.
+ Thực hiện 24 thớ nghiệm chuyển gen gus và hptII vào callus bốo tấm SP
+Chọn lọc và tỏi sinh cõy chuyển gen trờn mụi trường tỏi sinh cú bổ sung 10 mg/l geneticin (6-7 chu kỳ chọn lọc)’
+ Bèo sống sút sau chọn lọc đem tỏch chiết DNA và được kiểm tra bằng phương phỏp PCR .
3.4. Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ
Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bốo tấm nguyờn cõy Tf (%) = Tổng số cỏnh cú đốm xanh Tổng số cỏnh nhuộm x 100 Tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bốo tấm
Tc (%) = Tổng số callus cú đốm xanh Tổng số callus nhuộm x 100
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xõy dựng quy trỡnh chuyển gen vào bốo tấm sử dụng gen gus làm chỉ thị
4.1.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thớch hợp cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen ở bốotấm SP nguyờn cõy và callus tấm SP nguyờn cõy và callus
Cỏc chủng Agrobacterium tumefaciens khỏc nhau cú khả năng xõm nhiễm và cài gen vào tế bào thực vật khỏc nhau. Trong thớ nghiệm này, chỳng tụi sử dụng cỏc chủng vi khuẩn: chủng AA6 mang vectơ nhị phõn pBINGUSINT sbAvirG726pm và cỏc chủng EHA105, LBA4404, GV3101, AGL-1 mang vectơ pCAMBIA3101.
Mẫu bốo nguyờn cõy sử dụng trong thớ nghiệm thu được trờn mụi trường sinh trưởng sau 5 ngày nuụi cấy, mẫu callus thu được trờn mụi trường nhõn callus sau 2 tuần ngày nuụi cấy. Kết quả thớ nghiệm được trỡnh bày ở bảng 4.1 và hỡnh 4.1; 4.2
Kết quả thớ nghiệm ở bảng 4.1 cho thấy:
Ở cụng thức đối chứng (Đ/C) khụng cú vi khuẩn mà thay vào đú là dịch LB khụng cho biểu hiện màu xanh chàm của gen gus sau khi nhuộm X-gluc ở cả bốo tấm nguyờn cõy và callus dịch nhuộm trong suốt, như vậy kết quả thớ nghiệm hoàn toàn đỏng tin cậy, hiện tượng dương tớnh giả bị loại trừ.
Bảng 4.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thớch hợp cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen vào bốo tấm
CT
Chủng vi khuẩn
SP nguyờn cõy Callus SP
Tỷ lệ biểu hiện tạm thời (%) Mức độ biểu hiện Tỷ lệ biểu hiện tạm thời (%) Mức độ biểu hiện 1 LBA 4404 7,5 Đậm vừa 2,01 Nhạt 2 GV 3101 8,28 Đậm vừa 2,14 Nhạt
3 EHA105 2,54 Hơi đậm 5,6 Hơi đậm
4 AA6 5,49 Hơi đậm 0 -
Đ/ C
LB 0 - 0 -
Trong số 5 chủng vi khuẩn sử dụng trong thớ nghiệm thỡ chủng vi khuẩn AGL-1 cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bốo tấm SP nguyờn cõy đạt cao nhất 15,88%, mức độ biểu hiện màu xanh chàm đậm vừa. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở hai chủng LBA4404 và GV3101 sai khỏc khụng nhiều (lần lượt là 7,50% và 8,28%). Chủng EHA105 cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
gus thấp nhất 2,54%, mức độ biểu hiện nhạt hơn so với cỏc chủng vi khuẩn cũn lại. Do đú chỳng tụi lựa chọn chủng AGL-1 cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen nguyờn cõy tiếp theo.
Với callus SP, chủng LBA4404 và GV3101 cho biểu hiện màu xanh chàm của gen gus nhạt, tỷ lệ biểu hiện tạm thời thấp (2,01 và 2,14%). Chủng AGL-1 cho mức độ biểu hiện đậm vừa, tỷ lệ biểu hiện đạt cao nhất 12,5%. Do đú
EHA105 AA6
LBA4404
GV3101
AGL-1
Hình 4.1. Biểu hiện tạm thời của gen gus trờn SP nguyờn cõy sau khi lõy nhiễm với cỏc chủng vi khuẩn khỏc nhau.
chủng AGL-1 được chỳng tụi lựa chọn cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen vào callus bốo tấm SP tiếp theo.
Hỡnh 4.2. Biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bốo tấm SP
4.1.2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ởSP nguyờn cõy và callus SP nguyờn cõy và callus
Mật độ vi khuẩn thể hiện số tế bào vi khuẩn trong một đơn vị thể tớch và nú ảnh hưởng tới lượng tế bào vi khuẩn cú thể tiếp xỳc với mụ thực vật do đú cú thể ảnh hưởng tới hiệu quả của quỏ trỡnh chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cỏc mật độ vi khuẩn ở OD600 lần lượt là 0; 0,5; 0,8; 1,0; 1,2 và 1,5 đó được sử dụng trong thớ nghiệm. Kết quả thớ nghiệm được trỡnh bày ở bảng 4.2
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP
CT Mật độ vi khuẩn (OD600)
Tỷ lệ biểu hiện tạm thời ở
SP nguyờn cõy (%) Tỷ lệ biểu hiện tạm thời ở callus SP (%) Đ/C 0 0 0 1 0,5 12,31 9,27 2 0,8 19,15 15,11 3 1,0 15,65 12,15 4 1,2 14,50 8,24 5 1,5 10,70 7,52 Đ/C AGL-1
Kết quả thớ nghiệm cho thấy: Với bốo SP nguyờn cõy, mật độ vi khuẩn cú ảnh hưởng tới sự biểu hiện tạm thời của gen gus. Ở giỏ trị OD600 = 0,5 tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus chỉ đạt 12,31% nhưng khi OD600 = 0,8 thỡ tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus tăng lờn 19,15%. Tiếp tục tăng mật độ vi khuẩn, tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus giảm. Nguyờn nhõn là do ở mật độ cao cú sự cạnh tranh giữa cỏc tế bào vi khuẩn xung quanh cỏnh bốo làm ảnh hưởng tới hiệu quả của quỏ trỡnh chuyển T-DNA vào bốo tấm. Ở OD600 = 0,8 thỡ tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đạt giỏ trị cao nhất, mức độ biểu hiện đậm vừa, vựng biểu hiện rộng, giỏ trị OD này được chỳng tụi lựa chọn cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen nguyờn cõy tiếp theo.
Kết quả ở bảng 4.2 cũng cho thấy: Đối với callus bốo tấm SP thỡ mật độ vi khuẩn cũng ảnh hưởng tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus. Ở OD600 = 0,5 1,2 và 1,5 tỷ lệ biểu hiện của gen gus khỏc nhau khụng nhiều. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đạt cao nhất là 15,11% khi OD600 = 0,8, giỏ trị OD này được chỳng tụi lựa chọn cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen vào callus SP tiếp theo.
4.1.3. Ảnh hưởng của thời gian ly tõm chõn khụng tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyờn cõy và callus
Ly tõm tạo ra cỏc tổn thương ở bốo tấm SP tạo điều kiện cho vi khuẩn
A. tumefaciens xõm nhiễm vào bốo, cũn điều kiện chõn khụng thỡ làm tăng cường sự tiếp xỳc giữa bốo tấm với vi khuẩn để quỏ trỡnh chuyển gen được tiến hành thuận lợi hơn.
Trong thớ nghiệm này để xỏc định ảnh hưởng của thời gian ly tõm chõn khụng tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bốo tấm SP nguyờn cõy và callus, chỳng tụi bố trớ 5 cụng thức thớ nghiệm sử dụng chủng vi khuẩn AGL-1 cú OD600 = 0,8 với thời gian ly tõm chõn khụng lần lượt là: 0, 5, 10, 15 và 20 phỳt. Kết quả thớ nghiệm được trỡnh bày ở bảng 4.3
Kết quả thớ nghiệm ở bảng 4.3 cho thấy: Cú sự khỏc biệt lớn về tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyờn cõy giữa cụng thức đối chứng (khụng ly tõm) với cỏc cụng thức cú ly tõm chõn khụng. Ở cụng thức đối chứng, tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus chỉ đạt 8,65%, trong khi đú ở cỏc cụng thức cú ly tõm chõn khụng tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus dao động từ 12,71 đến 22,27%. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở thời gian ly tõm chõn khụng 15 và 20 phút sai khỏc khụng đỏng kể (lần lượt là 22,27% và 20,96%), tuy nhiờn ở thời gian ly tõm 15 phút cho biểu hiện vựng rộng và đậm hơn ở cụng thức ly tõm 20 phỳt. Thờm vào đú, thời gian ly tõm càng lõu thỡ càng gõy ra sự tổn thương cho cỏnh bốo và làm ảnh hưởng tới khả năng phục hồi của bốo tấm sau này. Do đú thời gian ly tõm chõn khụng huyền phự vi khuẩn với bốo tấm SP nguyờn cõy thớch hợp nhất là 15 phút, cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đạt 22,27%.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian ly tõm chõn khụng tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của