2 .4.3 Cơ chế phõn tử của chuyển gen thụng qua A.tumefaciens
4.1.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn thớch hợp cho cỏc thớ nghiệm chuyển
tấm SP nguyờn cõy và callus
Cỏc chủng Agrobacterium tumefaciens khỏc nhau cú khả năng xõm nhiễm và cài gen vào tế bào thực vật khỏc nhau. Trong thớ nghiệm này, chỳng tụi sử dụng cỏc chủng vi khuẩn: chủng AA6 mang vectơ nhị phõn pBINGUSINT sbAvirG726pm và cỏc chủng EHA105, LBA4404, GV3101, AGL-1 mang vectơ pCAMBIA3101.
Mẫu bốo nguyờn cõy sử dụng trong thớ nghiệm thu được trờn mụi trường sinh trưởng sau 5 ngày nuụi cấy, mẫu callus thu được trờn mụi trường nhõn callus sau 2 tuần ngày nuụi cấy. Kết quả thớ nghiệm được trỡnh bày ở bảng 4.1 và hỡnh 4.1; 4.2
Kết quả thớ nghiệm ở bảng 4.1 cho thấy:
Ở cụng thức đối chứng (Đ/C) khụng cú vi khuẩn mà thay vào đú là dịch LB khụng cho biểu hiện màu xanh chàm của gen gus sau khi nhuộm X-gluc ở cả bốo tấm nguyờn cõy và callus dịch nhuộm trong suốt, như vậy kết quả thớ nghiệm hoàn toàn đỏng tin cậy, hiện tượng dương tớnh giả bị loại trừ.
Bảng 4.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thớch hợp cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen vào bốo tấm
CT
Chủng vi khuẩn
SP nguyờn cõy Callus SP
Tỷ lệ biểu hiện tạm thời (%) Mức độ biểu hiện Tỷ lệ biểu hiện tạm thời (%) Mức độ biểu hiện 1 LBA 4404 7,5 Đậm vừa 2,01 Nhạt 2 GV 3101 8,28 Đậm vừa 2,14 Nhạt
3 EHA105 2,54 Hơi đậm 5,6 Hơi đậm
4 AA6 5,49 Hơi đậm 0 -
Đ/ C
LB 0 - 0 -
Trong số 5 chủng vi khuẩn sử dụng trong thớ nghiệm thỡ chủng vi khuẩn AGL-1 cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bốo tấm SP nguyờn cõy đạt cao nhất 15,88%, mức độ biểu hiện màu xanh chàm đậm vừa. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở hai chủng LBA4404 và GV3101 sai khỏc khụng nhiều (lần lượt là 7,50% và 8,28%). Chủng EHA105 cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
gus thấp nhất 2,54%, mức độ biểu hiện nhạt hơn so với cỏc chủng vi khuẩn cũn lại. Do đú chỳng tụi lựa chọn chủng AGL-1 cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen nguyờn cõy tiếp theo.
Với callus SP, chủng LBA4404 và GV3101 cho biểu hiện màu xanh chàm của gen gus nhạt, tỷ lệ biểu hiện tạm thời thấp (2,01 và 2,14%). Chủng AGL-1 cho mức độ biểu hiện đậm vừa, tỷ lệ biểu hiện đạt cao nhất 12,5%. Do đú
EHA105 AA6
LBA4404
GV3101
AGL-1
Hình 4.1. Biểu hiện tạm thời của gen gus trờn SP nguyờn cõy sau khi lõy nhiễm với cỏc chủng vi khuẩn khỏc nhau.
chủng AGL-1 được chỳng tụi lựa chọn cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen vào callus bốo tấm SP tiếp theo.
Hỡnh 4.2. Biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bốo tấm SP