Để đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn ở thực phẩm: sử dụng phương pháp lấy mẫu xét nghiệm. Các thông tin về từng xét nghiệm được ghi lại bằng phiếu xét nghiệm đã được chuẩn bị trước.
* Kỹ thuật lấy mẫu: Lấy mẫu thực phẩm theo quy định của FAO
(1988): Mẫu thực phẩm được lấy khách quan, đảm bảo tính đại diện cho cả lô, mẻ hàng được sản xuất ra và bày bán trên đường phố, trong các chợ bằng dụng cụ vô trùng do cán bộ khoa xét nghiệm thực hiện. Số lượng một mẫu thực phẩm: giò, chả, bánh phở không ít hơn 150g và được chứa trong hộp đựng mẫu bằng Inox đã được tiệt khuẩn ở 1800C trong 20 phút; số lượng mẫu thực phẩm là nước giải khát tươi không ít hơn 100ml và được chứa đựng trong chai thủy tinh vô trùng. Ngay sau khi lấy, mẫu được bảo quản trong bình lạnh ở nhiệt độ 0 – 50C và làm xét nghiệm tại Labo trong vòng 2 giờ.
* Các kỹ thuật, xét nghiệm được sử dụng: nuôi cấy, xác định số lượng
vi khuẩn trong 1 gam, 1 ml thực phẩm: Làm theo thường quy của FAO.
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí (TSVKHK): chỉ tiêu TSVKHK được sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh thực phẩm hơn là độ an toàn của thực phẩm.
Nguyên tắc: định lượng TSVKHK bằng cách đếm số khuẩn lạc trên
môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37 ± 10C trong thời gian từ 24 – 48 giờ. Số lượng VKHK trong 1g hoặc 1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.
Tiến hành: Cân chính xác 10g thực phẩm (hoặc 10 ml thực phẩm lỏng)
đã được chuẩn bị cho vào bình nón có chứa 90 ml Pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
Pha loãng mẫu: hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước Pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo.
Đổ đĩa: đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa Petri và 1 Pipet đã tiệt khuẩn riêng.
Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa Petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa Petri.
Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ± 10C trong điều kiện vô khuẩn. Rót vào từng đĩa 12-15ml môi trường thạch (c) hoặc (d), trộn đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần.
Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.
Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên bề mặt.
Ủ ấm: khi thạch đã đông, lật sấp các đĩa Petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 37 ± 10C từ 24 – 48 giờ.
Đọc kết quả: sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức.
- Coliform tổng số:
Nguyên tắc: dựa vào tính chất sinh vật hóa học của Coliform, đây là
những vi khuẩn có khả năng lên men đường Lactose, sinh axit và sinh hơi. Xét nghiệm này được thực hiện theo phương pháp MPN (Most Probable Number) với môi trường canh thang Lactose và sử dụng bảng chỉ số MPN để tính kết quả.
Tiến hành: cân vô trùng chính xác 10g thực phẩm đã được xay nhỏ
trong điều kiện vô trùng (hoặc cắt nhỏ trong điều kiện vô trùng), hoặc hút chính xác 10 ml thực phẩm lỏng cho vào bình nón có chứa 90 ml dung dịch nước đệm Pepton 9%. Lắc đều trong 2 phút ta được đậm độ pha loãng ban đầu 10-4. Tiếp tục pha loãng cho tới đậm độ không còn khả năng dương tính, tùy theo mẫu sạch hay bẩn mà pha loãng tới 10-3, 10-4, 10-5.
Nuôi cấy mẫu:
+ Bước 1: đối với 1 mẫu thực phẩm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ. Đậm độ đầu tiên (10-4) phải nuôi cấy vào 3 ống canh thang Lactose đặc và 3 ống canh thang Lactose loãng. Các đậm độ sau (10-2, 10-3…) mỗi đậm độ nuôi cấy trong 3 ống canh thang Lactose loãng.
Mỗi ống canh thang Lactose đặc cho 10 ml thực phẩm đã pha loãng. Mỗi ống canh thang Lactose loãng cho 1 ml thực phẩm đã pha loãng. Để tủ ấm 370C trong 24 giờ.
Đọc các ống dương tính: làm đục canh thang và sinh hơi. + Bước 2: cấy chuyển xác định tổng số Coliform
Từ những ống dương tính ở bước 1, dùng que cấy vô trùng cấy chuyển tương ứng canh trùng sang những ống canh thang Lactose mật bò.
Ống đặc sang ống đặc, ống loãng sang ống loãng, để tủ ấm 350C – 370C trong vòng 24 – 48 giờ.
Đọc các ống dương tính: chuyển màu môi trường từ tím sang đỏ sang vàng và sinh hơi.
Tổng số Coliform được xác định bằng số ống dương tính, sau khi nuôi cấy vào các ống canh thang Lactose mật bò ở 350C – 370C trong 24 - 48 giờ.
- Xác định E.coli: theo phương pháp Vincent
Nguyên tắc: dựa theo tính chất sinh vật hóa học của E.coli: phát triển
được ở môi trường có độ PH axit, nhiệt độ thích hợp 420C – 440C, lên men đường Lactose, sinh hơi nhiều, nhanh và sinh Indol.
Tiến hành: Cân 10g thực phẩm cần xét nghiệm, dùng kéo không gỉ cắt
nhanh, nhỏ thực phẩm và cho vào bình nón có chứa 90 ml canh thang. Để thời gian 10 phút, sau đó đem cấy chuyển vào môi trường Vincent để tìm E.coli, theo các bước sau:
+ Pha dung dịch kiểm nghiệm ở các nồng độ: nguyên chất, pha loãng 1/10
+ Ghi số mẫu và các dung dịch kiểm nghiệm trên các ống Vincent + Dùng Pipet vô khuẩn cho axit Phenic vào các ống:
Vincent đặc cho: 0,34ml (5 ống) Vincent loãng cho: 0,17ml (2 ống)
+ Cấy dung dịch kiểm nghiệm vào môi trường Vincent: cấy 5 ống Vincent đặc và 2 ống Vincent loãng:
Vincent đặc: cho vào 10ml dung dịch kiểm nghiệm nguyên chất/1ống
Vincent loãng 1: cấy 1ml dung dịch kiểm nghiệm nguyên chất Vincent loãng 2: cấy 1ml dung dịch kiểm nghiệm pha loãng 1/10
Cấy xong, xoay tròn các ống môi trường theo chiều vòng tròn từ dưới lên trên bằng cổ tay, để tủ ấm 420C – 440C, sau 24 giờ lấy ra kiểm tra.
Nếu các ống Vincent đục là có E.coli. Muốn xác định chắc chắn, dùng Pipet Pasteur vô khuẩn cấy 2 – 5 giọt Vincent đục vào:
Môi trường Pepton Lactose có ống sinh hơi (Dunham) để kiểm tra tính chất sinh hơi.
Môi trường Pepton pH 7,2 để kiểm tra tính chất sinh Indol.
Cấy xong, để tủ ấm 370C. Sau 24 giờ đem ra kiểm tra. Nếu ống Dunham trong môi trường Pepton Lactose có khí là kết quả sinh hơi dương tính, khi đó cần thử tiếp tính chất sinh Indol. Nếu trong ống Dunham không có khí là kết quả âm tính, do đó không cần thử tính chất sinh Indol nữa.
Thử Indol: trong ống Pepton pH 7,2 cho 1ml cồn Isoamylic nguyên chất, 3 – 5 giọt axit Nitric nguyên chất rồi lắc đều ống: nếu thấy trong ống xuất hiện một váng hồng cánh sen hay đỏ đậm nổi trên mặt môi trường hoặc toàn bộ môi trường đỏ hồng là có sinh Indol (Indol dương tính).
Tính kết quả: những ống Vincent sau khi cấy chuyển có sinh hơi và
Indol dương tính mới được tính kết quả.
+ Cứ mỗi ống Vincent đặc đục có sinh hơi và Indol dương tính là có 20 E.coli/lít dung dịch kiểm nghiệm.
+ 5 ống Vincent đặc đều đục có sinh hơi và Indol dương tính là có 100 E.coli/lít dung dịch kiểm nghiệm.
+ 5 ống Vincent đặc đều không sinh hơi và Indol âm tính là có dưới 20 E.coli/lít dung dịch kiểm nghiệm.
+ Ống Vincent loãng (ống 2): ống cấy 1ml dung dịch kiểm nghiệm pha loãng 1/10 có sinh hơi và Indol (+) là có 10.000.000 E.coli/lít dung dịch kiểm nghiệm.
- Xét nghiệm Clostridium perfringens: phương pháp Wilson – Blair
(theo thường quy Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương – 1997) [13].
Nguyên tắc: dựa tính chất của C. perfringens chịu được nhiệt độ cao và
sinh khí Hydrosunfua nên có khuẩn lạc bắt màu đen trong môi trường thạch Wilson Blair (WB).
Cách làm: nuôi cấy 10 ml thực phẩm lỏng hoặc 1g thực phẩm đặc đã
trộn lẫn trong 9 ml dung dịch Natri clorua đẳng trương vào môi trường Wilson Blair. Đun cách thủy cho tan môi trường, thêm 2ml dung dịch natrisunfit 5% và 5 giọt dung dịch ferosunfat 5%. lắc ống để trộn đều, tiếp tục đun cách thủy 750C trong 5 phút, làm lạnh ngay dưới vòi nước chảy hay trong tủ lạnh. Sau khi môi trường đã đông, để tủ ấm 370C trong 24 – 48 giờ. Đọc khuẩn lạc có màu đen, tròn (do tạo thành sắt sunfua).
Tính kết quả: đếm các khuẩn lạc màu đen tròn trong môi trường. Một
khuẩn lạc màu đen trong môi trường là 1 vi khuẩn C. perfringens. Số khuẩn lạc trong 10ml nước kiểm nghiệm được tính như sau:
A + 10B + 100C X vk/10ml =
n Trong đó:
X: số khuẩn lạc C. perfringens tính cho 10 ml nước kiểm nghiệm.
A: số khuẩn lạc đếm được ở ống môi trường cấy 10 ml nước kiểm nghiệm nguyên chất (không pha loãng).
B: số khuẩn lạc có ở ống môi trường cấy 10 ml nước kiểm nghiệm pha loãng 1/10.
C: số khuẩn lạc có ở ống môi trường cấy 10 ml nước kiểm nghiệm pha loãng 1/100.
Đánh giá các kết quả xét nghiệm
Việc đánh giá các kết quả xét nghiệm được dựa theo quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ Y tế về việc ban hành quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm, cụ thể:
STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Tiêu chuẩn
1 Giò: TSVKHK Coliform E.coli Cl. perfringens Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam < 105 < 50 0 < 102 2 Chả cá: TSVKHK Coliform E.coli Cl. perfringens Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam < 105 < 10 < 3 < 10 3 Bánh phở: TSVKHK Coliform E.coli Cl. perfringens Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam Vi khuẩn/gam < 104 < 10 < 3 < 10 4 Nước giải khát tươi:
TSVKHK Coliform E.coli Cl. perfringens Vi khuẩn/ml Vi khuẩn/ml Vi khuẩn/ml Vi khuẩn/ml < 102 < 10 0 0 2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Toàn bộ thông tin, số liệu điều tra kiến thức về VSATTP, tình trạng ô nhiễm thực phẩm được nhập vào máy tính và xử lý bằng phần mềm EPI INFO Version 6.0, SPSS 13.0 với các test thống kê Y sinh học.
Các số liệu của biến liên tục được kiểm tra phân bố chuẩn trước khi tính bằng test Skewness, Kurtosis, giá trị trung bình, trung vị, số tối đa, tối thiểu, độ lệch chuẩn. Nếu số liệu phân bố chuẩn sẽ sử dụng các test thống kê tham số: test t cho kiểm định sự khác nhau giữa 2 giá trị trung bình, test ANOVA cho kiểm định sự khác nhau giữa nhiều giá trị trung bình trong các nhóm. Nếu số liệu phân bố không chuẩn sẽ sử dụng các test thống kê phi tham số: sự khác nhau giữa giá trị trung vị được kiểm định bằng test Mann- Whitney.
So sánh sự khác nhau giữa các tỷ lệ sử dụng test χ2 . Nếu cỡ mẫu nhỏ, sử dụng Fisher, s exact test.
Sử dụng bảng tần số và biểu đồ để trình bày các kết quả đã đạt được.
2.6. Y đức trong nghiên cứu
Luận án được triển khai thực hiện trên cơ sở sau khi được Hội đồng khoa học trường Đại học Y khoa Thái Bình phê duyệt và thông qua. Cuộc điều tra được tiến hành trên cơ sở giải thích cho các đối tượng nghiên cứu hiểu rõ mục đích, lợi ích của cuộc điều tra, phỏng vấn để các đối tượng tự nguyện tham gia, hợp tác, chia sẻ, hỗ trợ; không gượng ép và trên tinh thần tôn trọng, sẵn lòng trả lời mọi thông tin khi phỏng vấn, đảm bảo cho kết quả điều tra chính xác, khách quan. Các thông tin thu được nhằm phục vụ cho mục đích nghiên cứu khoa học, đóng góp thêm một phần nhỏ cho các luận cứ khoa học phục vụ mục đích bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân dân; phát triển ngành thực phẩm và hội nhập. Đồng thời đây là dịp thông tin tuyên truyền cho những người tham gia nghiên cứu và cộng đồng hiểu biết thêm về cách chế biến thực phẩm và sử dụng thực phẩm.
2.7. Các biện pháp khống chế sai số
Đối với địa bàn nghiên cứu: chọn địa bàn có nhiều cơ sở sản xuất, chế biến và kinh doanh giò lụa, chả cá, bánh phở, nước giải khát tươi có
tính đại diện cao, có sự thống nhất trước với Ban quản lý chợ và chính quyền địa phương.
Sử dụng bộ câu hỏi dễ hiểu, dễ trả lời.
Tập huấn kỹ cho cán bộ điều tra, chú ý kỹ năng giao tiếp để tranh thủ sự hợp tác, chia sẻ của người được điều tra.
Cán bộ lấy mẫu và làm xét nghiệm được lựa chọn có trình độ, có kỹ năng thành thạo, có kinh nghiệm và trung thực.
Kiểm tra, làm sạch số liệu trước khi nhập vào máy tính để tránh sai, bỏ sót, nhầm lẫn và kiểm tra lại kết quả tính toán.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Thực trạng ô nhiễm vi khuẩn trong các mẫu thực phẩm
Bảng 3.1. Mức độ nhiễm khuẩn trong giò
Chỉ tiêu Cơ sở SXCB (n=16) Cơ sở KD (n=15) Chung (n=31)
Min Max Min Max Min Max
Coliform 40,2 0 102 57,1 0 102 48,4 0 102
E.Coli (VK/gr.) - - - 0,0 0 0
Cl.perfringens 0,2 0 5 0,3 0 5 0,3 0 5
TSVKHK 7,2 0 104 9,3 0 104 8,2 0 104
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: mức độ nhiễm khuẩn trung bình về chỉ tiêu Coliform (48,4 VK/gr) và TSVKHK (8,2 VK/gr) trong giò cao hơn chỉ tiêu E.Coli và Cl.perfringens. Không có sự khác biệt về mức độ nhiễm khuẩn trung bình trong giò giữa cơ sở SXCB và cơ sở kinh doanh.
Bảng 3.2. Mức độ nhiễm khuẩn trong chả
Chỉ tiêu Cơ sở SXCB (n=16) Cơ sở KD (n=15) Chung (n=31)
Min Max Min Max Min Max
Coliform 2,6 0 15 2,6 0 15 2,6 0 15
E.Coli (VK/gr.) 0,2 0 4 0,3 0 4 0,2 0 4
Cl.perfringens - - - 0,0 0 0
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: mức độ nhiễm khuẩn trung bình về chỉ tiêu TSVKHK (14,5 VK/gr) và Coliform (2,6 VK/gr) trong chả cao hơn chỉ tiêu E.Coli và Cl.perfringens. Không có sự khác biệt về mức độ nhiễm khuẩn trung bình trong chả giữa cơ sở SXCB và cơ sở kinh doanh.
Bảng 3.3. Mức độ nhiễm khuẩn trong bánh phở
Chỉ tiêu Cơ sở SXCB (n=16) Cơ sở KD (n=15) Chung (n=31)
Min Max Min Max Min Max
Coliform 1,1 0 103 1,1 0 103 1,1 0 103
E.Coli (VK/gr.) 8,1 0 102 9,0 0 102 8,6 0 102
Cl.perfringens 5,1 0 102 5,7 0 102 5,4 0 102
TSVKHK 139,9 100 105 165,4 100 105 152,2 100 105
Qua kết quả ở bảng 3.3 chúng tôi thấy: mức độ nhiễm khuẩn trung bình về chỉ tiêu TSVKHK (152,2 VK/gr) trong bánh phở là cao nhất, tiếp đến chỉ tiêu E.coli (8,6 VK/gr.), Cl.perfringens (5,4 VK/gr). Mức độ nhiễm khuẩn trung bình trong bánh phở giữa cơ sở SXCB và cơ sở kinh doanh là tương đương nhau.
Bảng 3. 4. Mức độ nhiễm khuẩn trong nước giải khát
Chỉ tiêu Cơ sở bán hàng (n=31) Min Max Coliform (VK/ml.) 326,7 0 103 E.Coli (VK/ml.) 2,3 0 102 Cl.perfringens (VK/ml.) 1,5 0 102 Tổng số VKHK (VK/ml.) 49,9 0 105
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy: mức độ nhiễm khuẩn trung bình về chỉ tiêu Coliform (326,7 VK/ml) và TSVKHK (49,9 VK/ml) trong nước giải khát cao hơn chỉ tiêu E.Coli và Cl.perfringens.
Bảng 3.5. Tỷ lệ các mẫu giò không đạt chỉ tiêu về vi khuẩn
Loại XN Cơ sở SXCB (n=16) Cơ sở KD (n=15) Chung (n=31) SL % SL % SL % Coliform (VK/gr.) 3 12,5(-) 2 13,3(-) 5 16,1 Tổng số VKHK 0 0(-) 2 13,3(-) 2 6,5
(-): p > 0,05, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê
Qua kết quả ở bảng 3.5 chúng tôi thấy: có 16,1% mẫu giò vi phạm chỉ số Coliform, 6,5% vi phạm chỉ số TSVKHK. Các mẫu giò ở cơ sở kinh doanh