2.2.1.Xây dựng qui trình TDM amikacin trên trẻ em dƣới 1 tuổi
- Xác định các thông số dƣợc động học của amikacin trên trẻ em dƣới 1 tuổi - Xác định MIC của vi khuẩn Gr (-) gây bệnh thƣờng gặp nhạy cảm với AMK - Xây dựng qui trình TDM amikacin bằng phƣơng pháp mô phỏng Monte Carlo
2.2.2.Thử nghiệm qui trình TDM amikacin trên trẻ em dƣới 1 tuổi tại bệnh viện Nhi Trung ƣơng
- Đánh giá tính hiệu quả của qui trình TDM amikacin - Đánh giá tính an toàn của qui trình TDM amikacin
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Xây dựng qui trình TDM amikacin trên trẻ em dƣới 1 tuổi
2.3.1.1. Xác định các thông số dược động học của amikacin trên trẻ em dưới 1 tuổi
* Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Cỡ mẫu để xác định các thông số dƣợc động học của amikacin trên trẻ em dƣới 1 tuổi đƣợc tính theo công thức tính cỡ mẫu cho một giá trị trung bình trong nghiên cứu quan sát nhƣ sau [68]:
Trong đó: ; : độ lệch chuẩn của nồng độ thuốc trong máu (Cpeak) qua khảo sát của chúng tôi là 12 µg/ml. Sai số trong định lƣợng nồng độ amikacin trong máu d = 3 µg/ml. N = 61,45. Ƣớc tính tỉ lệ bệnh nhân tham gia nghiên cứu là 80%, số lƣợng bệnh nhân cần cho nghiên cứu là 75 bệnh nhân.
Cách chọn mẫu: nghiên cứu đƣợc tiến hành tại khoa Sơ sinh và khoa Miễn dịch - Dị ứng, bệnh viện Nhi TƢ. Bệnh nhân đƣợc lựa chọn vào nghiên cứu bắt đầu từ
38
03/2009 đến 05/2012. Sử dụng phƣơng pháp chọn mẫu thuận tiện cho đến khi lấy đủ số bệnh nhân nghiên cứu.
Chế phẩm: Amikacin – sản phẩm của hãng Sopharma (thuộc danh mục thuốc bệnh viện). Dạng đóng gói: ống 2mL, 125mg/mL hoặc 250mg/mL.
AMK đƣợc dùng theo hƣớng dẫn của bệnh viện Nhi TƢ với chế độ liều dùng ODD là 15mg/kg/ngày. Thuốc đƣợc pha với nƣớc cất để tiêm bolus tĩnh mạch chậm hoặc pha với dung dịch NaCl 0,9% thành nồng độ 5mg/ml và đƣa vào tĩnh mạch bằng bơm tiêm điện trong 30 phút.
* Lấy máu
Mỗi bệnh nhân đƣợc lấy 3 mẫu máu tại trạng thái ổn định (sau khi tiêm amikacin liều thứ 3):
Mẫu 1: đo nồng độ đỉnh (Cpeak), lấy sau 60 phút kể từ khi bắt đầu tiêm/truyền Mẫu 2: đo nồng độ trung gian (C6h), lấy sau 6 giờ kể từ khi bắt đầu tiêm/truyền. Mẫu 3: đo nồng độ đáy (Ctrough), lấy sau 24 giờ kể từ khi bắt đầu tiêm/truyền. Thể tích mẫu máu: 1,5ml máu động mạch hoặc tĩnh mạch.
* Xử lý mẫu máu
Máu đƣợc cho vào ống nghiệm không có chất chống đông, để đông tự nhiên, ly tâm, tách lấy huyết thanh. Huyết thanh sau đó đƣợc cho vào ống nghiệm, nút kín, mã hóa và để đông lạnh ở -20 C hoặc sâu hơn. Rã đông trƣớc khi định lƣợng.
Việc định lƣợng nồng độ thuốc trong máu để xác định các thông số dƣợc động học trên bệnh nhân đƣợc tiến hành thông qua sự chấp thuận của HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨCtrong nghiên cứu y sinh học xét duyệt đề cƣơng nghiên cứu đề tài khoa học công nghệ bệnh viện Nhi Trung Ƣơng (xem phụ lục 3).
* Định lượng nồng độ amikacin trong máu
Việc định lƣợng nồng độ amikacin trong máu đƣợc tiến hành tại khoa Sinh hóa – bệnh viện Nhi TƢ. Sử dụng thuốc thử Syva Emit Amikacin Assay trên máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU640. Thuốc thử và các kit thử do hãng Siemens cung cấp.
39
- Phƣơng pháp định lƣợng: phƣơng pháp định lƣợng AMK sử dụng kỹ thuật miễn dịch gắn enzym thuần nhất (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique - EMIT) để định lƣợng các hợp chất đặc hiệu trong dịch sinh học.
- Giới hạn định lƣợng: 0,8 µg/ml. - Nguyên lý:
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên lý gắn cạnh tranh giữa thuốc trong mẫu thử với thuốc đƣợc đánh dấu bằng enzym glucose-6- phosphat dehydrogenase (G6PDH) tại các vị trí gắn của kháng thể. Hoạt độ enzym giảm khi gắn với kháng thể, vì vậy nồng độ thuốc có thể định lƣợng đƣợc dựa trên việc đo hoạt độ enzym. Enzym hoạt động xúc tác chuyển coenzym NAD thành NADH, làm tăng mật độ quang và sự biến đổi mật độ quang này đƣợc đo bằng phƣơng pháp quang phổ.
- Qui trình định lƣợng:
+ Mẫu máu của bệnh nhân đƣợc ủ với một lƣợng kháng thể (dƣ thừa) đã xác định trƣớc tạo thành phức hợp Thuốc – Kháng thể.
+ Thêm một lƣợng phức hợp Enzym – Thuốc. Phức hợp này sẽ kết hợp với phần kháng thể thừa tạo thành phức hợp Enzym – Thuốc – Kháng thể. Các phức hợp Enzym – Thuốc khác sẽ ở dạng không gắn với kháng thể.
+ Khi thêm cơ chất, chỉ những phức hợp ở dạng Enzym – Thuốc không gắn với kháng thể mới có thể thủy phân cơ chất. Nhƣ vậy enzym chỉ hoạt hóa khi gắn với thuốc còn bất hoạt hóa khi gắn với kháng thể.
+ Đo phổ hấp thụ sau khi thêm chất nền 15-45 giây.
+ Tính toán lƣợng enzym - cơ chất qua quang phổ UV VIS. + Tính toán lƣợng enzym dƣ thừa.
+ Xác định đƣờng cong chuẩn.
Công thức tính các thông số dược động học
Dựa vào nồng độ thuốc đo đƣợc trên từng bệnh nhân, các thông số dƣợc động học (ke, Vd, Cl, t1/2) của AMK đƣợc tính toán theo công thức sau [26]:
40 – – (1) (2) Cl = ke Vd (3) (4) (5) Trong đó: ke : hằng số tốc độ thải trừ (h-1 ) t1/2 : thời gian bán thải (h)
t: thời gian tính từ khi bắt đầu tiêm/ truyền đến khi lấy máu lần 1 (1 giờ) Thời gian truyền (0,5 giờ)
Cl: độ thanh thải AMK (L/h/kg hoặc ml/phút) Vd: thể tích phân bố (L/kg)
Cpeak (µg/mL): nồng độ AMK tại thời điểm 1giờ kể từ khi bắt đầu tiêm. C6h (µg/mL): nồng độ AMK tại thời điểm 6giờ kể từ khi bắt đầu tiêm. Ctrough (µg/mL): nồng độ AMK tại thời điểm 24giờ kể từ khi bắt đầu tiêm. D: liều dùng (mg/kg)
Khi nồng độ đáy nằm dƣới giới hạn định lƣợng thì sử dụng nồng độ đáy ngoại suy theo công thức sau [26]:
Ctrough, ss=Cpeak, ss. e-[ke( -t’)]
Trong đó: t’: 1 giờ; : là khoảng cách giữa các lần đƣa thuốc (24 giờ)
Công thức tính độ thanh thải creatinin (CrCl) [144] đƣợc tính nhƣ sau:
CrCl (ml/min/1,73m2) = [chiều cao (cm) x 41,2] / Creatinin máu (µmol/l).
2.3.1.2. Xác địnhMIC của vi khuẩn Gr (-) gây bệnh thường gặp nhạy cảm với AMK
* Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Nghiên cứu PK/PD sử dụng các giá trị MIC của vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh để thiết kế liều dùng phù hợp cho mục đích TDM trên bệnh nhân. Trong nghiên cứu này, các chủng vi khuẩn sau khi đƣợc xác định là vi khuẩn Gr (-) gây bệnh thƣờng gặp tại bệnh viện và nhạy cảm với AMK trên hệ thống máy định danh vi khuẩn sẽ đƣợc sàng lọc và lƣu trữ để xác định MIC AMK bằng phƣơng pháp E-test.
41
Do điều kiện thời gian và kinh phí, chúng tôi dự kiến cỡ mẫu cho mỗi vi khuẩn để xác định MIC amikacin bằng phƣơng pháp E – test là 40 chủng, sai số do vi khuẩn chết hoặc do kỹ thuật là 25%. Vì vậy với mỗi chủng vi khuẩn phân lập đƣợc nếu có số lƣợng lớn (n > 40) thì dùng phƣơng pháp chọn ngẫu nhiên để lấy 40 chủng vi khuẩn. Với những chủng vi khuẩn có số lƣợng ≤ 40 chủng thì lấy toàn bộ số vi khuẩn thuộc chủng đó.
* Ðịnh danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ tự động
Việc phân lập và xác định vi khuẩn gây bệnh đƣợc tiến hành theo các nguyên tắc xét nghiệm vi sinh thƣờng qui và đƣợc tiến hành tại khoa Vi sinh - bệnh viện Nhi TƢ. Các đặc điểm về hình thái, sinh hoá của vi khuẩn đƣợc xác định bằng cách kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (primary test) và sử dụng bộ kit API 20E, API 20NE của hãng bioMérieux Clinical Diagnostics. Vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc đƣợc xác nhận lại và làm kháng sinh đồ bằng máy Vitek 2 Compact 60 do hãng bioMérieux Clinical Diagnostics sản xuất, sử dụng bộ card GN13 để chẩn đoán vi khuẩn Gr (-).
* Xác định MIC amikacin của vi khuẩn Gr (-) bằng phương pháp E-test
- Nguyên lý:
Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán và pha loãng. Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên các đĩa thạch Meuller-Hinton. Que thử E-test để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đƣợc cấu tạo bằng nitrocellulose tẩm kháng sinh, một đầu là AMK theo bậc thang nồng độ và đầu kia là ceftazidim + acid clavulanic. Khi đặt que E-test trên môi trƣờng đã trải vi khuẩn, kháng sinh từ que khuyếch tán ra môi trƣờng theo gradient nồng độ và ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạo thành vùng vô khuẩn có hình elip. Giá trị MIC đƣợc xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó không có sự phát triển của vi khuẩn.
- Các bƣớc tiến hành:
. Cấy vi khuẩn lên đĩa thạch Mueller Hinton bằng cách ria đều huyền dịch vi khuẩn lên khắp bề mặt thạch(đƣờng kính 90mm, thạch sâu khoảng 4,0 ± 0,5mm, pH 7,2-7,4) bằng cách xoay đĩa thạch 60o mỗi lần.
. Để bề mặt thạch khô hoàn toàn trong 15-20 phút.
. Đặt thanh giấy E-test AMK của hãng bioMérieux SA (nồng độ 0,0016 – 256mg/L) lên trên bề mặt thạch đã cấy vi khuẩn, kháng sinh sẽ khuếch tán trên bề mặt thạch.
42
. Đọc kết quả bằng mắt thƣờng trên thanh E-test để xác định MIC. Vi khuẩn bị ức chế sẽ tạo hình e-lip bắt chéo với thanh giấy E-test. Giá trị MIC đƣợc đọc tại vị trí điểm cắt giữa hình e-lip với thanh E-test (Hình 2.1).
Hình 2.1. Xác định MIC AMK trên vi khuẩn Gr (-) bằng phương pháp E - test * Tiêu chuẩn biện giải kết quả
Tiêu chuẩn đánh giá vi khuẩn nhạy cảm với amikacin căn cứ theo EUCAST 2011 [164], đƣợc trình bày trong Bảng 2.1:
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn biện giải vi khuẩn nhạy/ /kháng với AMK
Tiêu chuẩn Nhạy
(Susceptible – S)
Kháng (Resistance – R)
MICs ≤ 8 µg/ml > 8 µg/ml
2.3.1.3. Xây dựng qui trình TDM amikacin bằng phương pháp mô phỏng Monte Carlo
2.3.1.3.1 Phương pháp mô phỏng Monte Carlo
Nguyên lý: Mô phỏng Monte Carlo là một ứng dụng của phép phân tích nhân quả sử dụng cả mô hình bảng tính và mô phỏng để phân tích tác động của các đại lƣợng biến đổi ở đầu vào lên các đại lƣợng ở đầu ra của mô hình hệ thống. Phƣơng pháp này tạo ra các giá trị ngẫu nhiên cho các yếu tố (biến) không chắc chắn dùng để mô phỏng một mô hình. Mô phỏng Monte Carlo có thể thực hiện việc lấy mẫu ngẫu nhiên từ quần thể với
43
độ lặp lại 10000 lần nhằm mục đích ƣớc tính sự phân phối của biến kết quả mà biến này lại phụ thuộc vào sự biến đổi của một số biến đầu vào.
Phƣơng pháp mô phỏng Monte Carlo đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu này để xác định giá trị Cpeak và tỉ số Cpeak/MIC trên bệnh nhân tại một mức liều dùng giả định.
2.3.1.3.2 Đánh giá tính hiệu quả của chế độ liều dùng amikacin
Hiệu quả của chế độ liều dùng amikacin đƣợc đánh giá thông qua tỉ lệ bệnh nhân đạt chỉ số PTA và CFR (đƣợc xác định dựa trên tỉ lệ bệnh nhân đạt tỉ số Cpeak/MIC ≥ 8), đƣợc xác định nhƣ sau:
- PTA (Pharmacokinetic/ Pharmcodynamic target attainment): là tỷ lệ đạt đích PK/PD của amikacin. Chỉ số PTA đƣợc xác định bằng tỉ lệ bệnh nhân có Cpeak gấp 8 lần các giá trị MIC giả định.
- CFR (Cumulative fraction of response): là tỷ lệ đáp ứng tích luỹ trên phân bố MIC thực tế của quần thể vi khuẩn và của từng chủng vi khuẩn. CFR đƣợc xác định bằng tỉ lệ bệnh nhân có Cpeak /MIC ≥ 8.
2.3.1.3.3 Đánh giá tính an toàn của chế độ liều dùng amikacin
Tính an toàn của chế độ liều dùng hiện tại đƣợc đánh giá thông qua mức nồng độ đáy. Đích nồng độ đáy AMK đƣợc tham khảo từ các hƣớng dẫn TDM AMK cho trẻ em đang đƣợc thực hiện tại các cơ sở điều trị có dƣợc lâm sàng phát triển tại các nƣớc trên thế giới. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tiêu chuẩn của Hệ thống bệnh viện đại học Geneve đang áp dụng hiện nay [163] là:
Ctrough< 2,5 µg/ml.
2.3.1.3.4 Xác định chỉ số PTA
- Tại mức liều hiện tại (15mg/kg): từ dữ liệu phân bố Cpeak thực tế của bệnh nhân, tính tỉ lệ bệnh nhân có Cpeak cao gấp 8 lần các giá trị MIC giả định.
- Tại mức liều TDM: các dữ liệu về thông số dƣợc động học Ke, Vd (trung bình và độ lệch chuẩn) của bệnh nhân đƣợc sử dụng làm biến đầu vào trong mô phỏng Monte Carlo để tính toán biến đầu ra là Cpeak. Tính tỉ lệ bệnh nhân có Cpeak cao gấp 8 lần các giá trị MIC giả định.
44
2.3.1.3.5 Xác định chỉ số CFR
- Xác định chỉ số CFR tại mức liều hiện tại (15mg/kg): thực hiện mô phỏng Monte Carlo với biến đầu vào là Cpeak thực tế của bệnh nhân và MIC thực tế của vi khuẩn. Biến đầu ra đƣợc tính bằng tỉ số Cpeak /MIC của từng bệnh nhân. Chỉ số CFR là tỉ lệ bệnh nhân đạt tỉ số Cpeak /MIC ≥ 8.
- Xác định chỉ số CFR tại mức liều TDM: kết quả Cpeak của mức liều TDM amikacin đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp dƣợc động học và đƣợc đƣa vào mô phỏng Monte Carlo với cách làm tƣơng tự nhƣ với mức liều 15mg/kg.
2.3.1.3.6 Công thức tính Cpeak
Cpeak dự kiến khi tăng mức liều đƣợc tính toán áp dụng mô hình dƣợc động học một ngăn, thải trừ bậc 1 và phƣơng trình động học tuyến tính theo công thức Sawchuk – Zaske [26]:
] Trong đó:
Do là mức liều TDM
là nồng độ đỉnh dự kiến tại mức liều dùng 20mg/kg/ngày là hằng số tốc độ thải trừ
V là thể tích phân bố (L/kg)
là khoảng cách giữa 2 lần lấy máu (23 giờ)
t’: khoảng thời gian kể từ khi kết túc tiêm đến khi lấy máu lần 1 (0,5 giờ).
2.3.2.Thử nghiệm TDM AMK trên trẻ em tại bệnh viện Nhi TƢ
2.3.2.1. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Để đảm bảo tính an toàn và tính khả thi của qui trình TDM amikacin trên trẻ em, biện pháp can thiệp khoảng cách liều đƣợc áp dụng nhằm đạt đích Ctrough an toàn trên bệnh nhân.
Để so sánh tỉ lệ đạt nồng độ đáy trƣớc và sau khi can thiệp khoảng cách liều dùng giữa 2 nhóm, chúng tôi chọn mức ý nghĩa α = 0,05 và hiệu lực của nghiên cứu 1-β = 80% để đƣợc chấp nhận đối với một nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng.
45
Cỡ mẫu để so sánh 2 tỉ lệ bằng phƣơng pháp kiểm định Chi bình phƣơng ( 2 test) đƣợc áp dụng theo công thức sau [162]:
p1 là tỉ lệ đạt yêu cầu về nồng độ đáy ở nhóm không can thiệp chế độ liều dùng qua khảo sát của chúng tôi là 74%.
p2 là tỉ lệ đạt yêu cầu về nồng độ đáy ở nhóm can thiệp chế độ liều dùng, chúng tôi kỳ vọng tỉ lệ này đạt 90%.
= , tính đƣợc n = 83,13
Cỡ mẫu tối thiểu là n = 83 x 2 = 186 bệnh nhân.
Cách chọn mẫu: nghiên cứu đƣợc tiến hành tại khoa Sơ sinh - khoa Hô hấp, bệnh viện Nhi TƢ. Bệnh nhân đƣợc lựa chọn vào nghiên cứu bắt đầu từ tháng 7/2011 sử dụng phƣơng pháp chọn mẫu thuận tiện cho đến khi lấy đủ số bệnh nhân nghiên cứu.
Việc thử nghiệm TDM amikacin trên trẻ em dƣới 1 tuổi đƣợc thông qua sự chấp thuận của HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC- bệnh viện Nhi Trung Ƣơng (phụ lục 3).
Bệnh nhân đủ tiêu chuẩn lựa chọn vào nghiên cứu đƣợc chia làm 2 nhóm:
Nhóm can thiệp (CT- 1): là nhóm bệnh nhân đƣợc can thiệp liều dùng và giãn khoảng cách liều theo chế độ TDM.
Nhóm không can thiệp (KCT- 2): là nhóm bệnh nhân sử dụng liều ban đầu theo chỉ định của bác sĩ, đang đƣợc áp dụng cho trẻ em tại bệnh viện Nhi TW (liều 15mg/kg/ODD).
2.3.2.2. Cách pha thuốc, tính liều và tiêm thuốc cho bệnh nhân
Pha dung dịch tiêm AMK trong NaCl 0,9% hoặc Glucose 5% thành dung dịch gốc 2,5mg/ml cho trẻ sơ sinh và dung dịch 5mg/ml cho trẻ lớn. Dung dịch gốc này đƣợc chuẩn bị sẵn cho toàn bộ trẻ sơ sinh trong khoa trƣớc giờ tiêm.
Việc tính liều đƣợc đối chiếu theo bảng qui đổi giữa cân nặng của bệnh nhân ra liều dùng tính theo mg và tính theo ml thể tích dung dịch gốc (phụ lục 1). Việc rút liều