Các chủng nghiên cứu đƣợc tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh học để bƣớc đầu phân loại theo phƣơng pháp vi sinh thông thƣờng. Kết quả ở bảng 9.
Nội dung HD1 HD5
Hình dạng khuẩn lạc Tròn, nhẵn bóng, trắng đục, nhầy.
Tròn, không bóng, trắng đục, mép nhăn.
Hình thái tế bào Que, ngắn, rời rạc hoặc
xếp chuỗi ngắn
Que, ngắn, rời rạc hoặc xếp chuỗi ngắn
Nhuộm Gram Gram dƣơng Gram dƣơng
Hình thành nội bào tử
Có Có
Bảng 9: Một số đặc tính sinh học của các chủng nghiên cứu
Căn cứ các đặc điểm trên và đối chiếu với bảng phân loại của Bergeycó thể khẳng định rằng các chủng nghiên cứu trên có khả năng thuộc chiBacillus.
Từ cơ sở lý thuyết và thực tiễn tôi nhận thấy, trong công tác bảo vệ cây trồng việc sử dụng các loại thuốc hoá học đang ngày càng khiến cho môi trƣờng bị ô nhiễm trầm trọng. Kéo theo đó là hệ sinh thái đang bị suy thoái, mất cân bằng sinh
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 52 học. Nhƣ vậy việc thay thế các loại thuốc hoá học bằng các chế phẩm sinh học là công việc hết sức cấp thiết.
Một trong các tác nhân gây hại cho thực vật phải kể đến là các loại nấm, côn trùng chích hút và giun ăn rễ. Đặc điểm chung của các tác nhân gây hại là chúng đều có thành tế bào hoặc lớp vỏ ngoài là kitin, một loại polysaccarit phổ biến trong tự nhiên. Thêm vào đó, bản thân thực vật, vi sinh vật trong đất chứa một lƣợng kitinaza rất lớn. Vì vậy, nghiên cứu các chế phẩm sinh học có hoạt tính kitinaza để ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật nói riêng và bảo vệ môi trƣờng nói chung là rất cần thiết
Một thực tiễn cho thấy, trong những năm qua, dịch ốc bƣơu vàng đã bùng phát tại nƣớc ta, bà con nông dân thu thập ốc làm nguồn thức ăn cho chăn nuôi, nhƣng ngƣợc lại vỏ ốc thì chất đống gây ô nhiễm môi trƣờng rất trầm trọng. Với hàm lƣợng cao trong sản phẩm phế liệu này, tại sao không tận dụng chúng để tạo các sản phẩm hữu ích.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 53
KẾT LUẬN
1. Từ mẫu đất làm giàu, tôi đã phân lập đƣợc 35 chủng vi khuẩn. Tiến hành thử hoạt tính có 11 chủng có hoạt tính kitinaza.
2. Chọn lọc 2 chủng sinh kitinaza cao nhất xác định đƣợc nhiệt độ tối ƣu của chủng HD1 là 400C, chủng HD5 là350 C. PH tối ƣu của chủng HD1 là7,0; chủng HD5 là7,5 và nồng độ cơ chất tối ƣu của cả hai chủng HD1 và HD5 là 15‰.
4. Thử hoạt tính kitinaza 2 chủng trên cả kitin thô và kitin tinh chế thấy nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất tối ƣu là không đổi.
5. Hoạt tính enzym tƣơng đối ổn định sau 4 tuần bảo quản tại 40C.
6. Nếu trong điều kiện không có kitin tinh chế có thể sử dụng kitin thô độ chính xác vẫn đảm bảo.
7. Cả 2 chủng trên đều có hoạt tính kháng nấm.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 54
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm kitinaza sinh học ứng dụng vào sản xuất góp phần giảm ô nhiễm môi trƣờng từ nguồn phế liệu giàu kitin.
2. Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen có hoạt tính kitinaza để tăng các loài sinh vật có khả năng phòng trừ nấm hại. 3. Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm kitin thô trong bảo vệ thực vật.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Đặng Văn Luyến, “Chitin/Chitosan”. Các bài giảng và báo cáo chuyên đề, tập 2, tr 27-35, 1995
2. Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và một số cộng sự. “ Hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan và chế biến một số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua” Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bộ. Nha Trang.2000. 3. Isolation and Characterization of Halophilic Alkaliphilic Bacteria Producing
Protease and their Use to Accelerate Fish Sauce Fermentation Nguyễn Văn Lâm1, Nguyễn Phƣơng Nhuệ2, Trịnh Thị Ngọc.
Tài liệu nƣớc ngoài
4. Anand A, Lei ZT, Sumner LW, Mysore KS, Arakane Y, Bockus WW, Muthukrishnan S. 2004. Mol Plant Microbe In 17 (12): 1306-1317.
5. Baneriee U.C., Sani R.K.,Azmi W.,Soni R. (1999), “ Thermostable alkaline chitinase from Bacillus brevis and its characterization as a laundry detergent additive”, Biochemistry, 35 (1-2), pp. 213-19.
6. Cottrell MT, Moore JA, Kirchman DL. 1999. Appl Environ Microb, 65 (6): 2553-2557.
7. Davis, B., and Eveleigh , D. E., 1984, Chitosanase: Occurrence, production and immobilization, in: Chitin, Chitosan and Related Enzymes ( J. P. Zikakis, ed), pp. 161- 179, Academic Press, Orlando.
8. Deshpande, MV 1986. Journal of Scientific and Industrial Research 45:273- 281
9. Enzymology, RAA Muzzarelli (ed). Atec Edizioni, Italia. 2:125- 133. 10. Flach. J., Pilet PE, and Jolles P.1992. Experientia 48, pp-701-716.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 56 11.Fergus G.Priest, Extraccellular Enzyme Synthesis in the genus Bacillus,
Bacteriologycal Reviews, 41 (3), p. 711- 753. 12.Fuchs, RL, McPherson, SA and Drahos,
DJ1986. Appl. Environ. Microbiol. 51, 504.
13.Gardner, H. H., and Blackwell, J., 1975, Refinement of the structure of β- chitin, Biopolymers 14: 1581- 1595.
14. Gokul, B Lee, JH Song, KB Rhee, SK Kim, CH Panda, T. 2000, Bioprocess Eng. 23(6):691-694
15.Gooday, G.W., 1983, The microbial synthesis of cellulose, chitin and chitosan, Pro. Ind. Microbiol. 18: 85- 127.
16.Goorich, T. D., and Morita, R .Y., 1977a, Incidence and estimation of chitinase activity associated with marine fish and other estuarine sample, Mar. Biol. 41: 349- 353.
17.Hackman R.H. (1962). Studies on Chitin. 5. Action of Mineral Acids on Chitin Australian Journal of Biological Sciences 15 (3): 526- 532.
18. Henrissat BI and Bairoch A. 1993. Biochem. J., 293, 781-788. 19.Herrera-Estrella A. & Chet, I. 1999. EXS 87, 171.
20.Hillman, K., Gooday, G. W., and prosser, J. I., 1989, A simple model system for small scale in vitro study of estuarine sediment ecosystems, Lett. Appl. Microbiol. 8: 41- 44.
21.Kenneth J.Ryan (2004), Bacillus, Shrris Medical Microbiology
22. Koga D, Hoshika H, Matsushita M, Tanaka A, Ide A, Kono M. 1996. Biosci Biotech Bioch 60 (2): 194-199.
23. Linden, J., Stoner, R., Knutson, K. Gardner-Hughes, C. "Organic Disease Control Elicitors". Agro Food Industry Hi-Te .p12-15 Oct 2000.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 57 24.Lorito M, Sheridan I., Woo, Gary EH, Sposato P., Muccifora S. and Scala F.1996. Genes enconding for chitinolytic enzymes from biocontrol fungi: applications for plant disease control. In: Chitin Enzymology. RAA Muzzarelli (ed). Atec Edizioni, Italia.2:95-101.
25.Lutz, MP, Wenger S., Maurhofer, M., Dèfago G., Duffy B. 2004. FEMS Microbiol Ecol 48:447-455.
26. Mayer RT, McCollam TG, Niedz RP, Hearn CJ, McDonald RE, Berdis E, Doostdar H. 1996. Planta 200 (3): 289-295.(25cũ)
27.Melchers, LS & Stuiver, MH 2000.Curr. Op. Plant Biol. 3, 147.(26cũ)
28.Minke, R., and Blackwell, J., 1978, The structure of α- chitin, J. Mol. Biol. 120: 167- 181.
29.Mitchen, R., and Alexander, M., 1962, Microbiological processes associated with the use of chitn for biological control, soil Sci. Soc. Am. Proc. 26: 556- 558.
30.Natural Photonics Group Dr. Peter Vukusic, Roy Sambles University of Exeter. "Wing scales diffract and scatter light: Morpho butterflies". The Biomimicry Institute. Retrieved April 8, 2012
31.Patil R, Ghormade V, Deshpande M. 2000. Enzyme Microb Technol, 26:473- 483.37. Adams, DJ 2004. Microbiology, 150:2029-2035.
32.Perez C. and C. Anesini. 1993. In vitro antimicrobial activity of Argentine folk medicinal plants against Salmonella typhii. Journal of Ethnopharmacology. 44: 41-46
33.Revah-Moiseev, S. and Carroad, PA 1981. Biotechnol Bioeng, 23:1067- 1078.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 58 35. Rojas-Avelizapa LI, Cruz-Camarillo R, Guerrero MI, Rodriguez-Vazquez
R, Ibarra JE .1999. World J Microb Biot 15 (2): 299-308.
36.Rudall, K. M., and Kenchington, W.., 1973, The chitin system, Biol. Rev. 48: 597- 636.
37.Rudrapatnam N., Tharanathan and Farooqahmed S. Kittur. 2003. Crit Rev Food Sci Nutr, 43(1):61.87.
38.Sahai, AS and Manocha, MS 1993. FEMS Microbiol. Rev., 11:317-338. 39.Salzer P, Feddermann N, Wiemken A, Boller T, Staehelin C. 2004. Planta
219 (4): 626-638.
40.Simpson, BK; Gagne, N. and Simpson, MV 1994. Bioprocessing of chitin and chitosan. In: Fisheries Processing: Biotechnological applications. AM Martin (Ed.). Chapman and Hall. London.155-173.
41.Shirai, K., Guerrero, I. and Hall, GM 1996. La quitina, ocurrencia, propiedades yaplicaciones. Ciencia 47 (4):317-328.
42.S.Kavi Karunya, D.Reetha, P.Saranraj and D. John Milton. Department of Microbiology,Annamalai University,Chidambaram – 608 002, India. Received 24 Aug 2011; Revised 26 Oct 2011; Accepted 07 Nov 2011
43.Smucker, R.A., 1984, Biochemistry of the streptomyces spore sheath, in: Biologycal, Biochemical and Biomedical Aspects of Actinomycetes ( L. Ortiz- Ortiz, L. F. Bojalib, and V. Yakoleff, eds.), pp. 171- 177, Academic Press, Orlando.
44.Smucker, R.A., and Dawson, R., 1986, products of phytosynthesis by marine phytoplankton: chitin in CTA „ protein‟ precipitase, J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 104: 397- 408.
45.Sundheim, L., Poplawsky, AR & Ellingboe, AH 1988. Phys. Mol. Plant Path. 33, 483.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 59 46.S.Kavi Karunya, D.Reetha, P.Saranraj and D. John Milton. Department of Microbiology,Annamalai University,Chidambaram – 608 002, India. Received 24 Aug 2011; Revised 26 Oct 2011; Accepted 07 Nov 2011
47.Todar‟s online Textbook of bacteriology ( 2008), Gram positive aerotic or faculative endospore forming bacteria ( formerly, „the genus Bacillus”).
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 60 PHỤ LỤC Phụ lục 01 Nhiệt độ 0 C Số lƣợng tế bào ( x 108 CFU/ ml) HD1 HD5 25 Kitin tinh sạch 14 12 Kitin thô 6 8 30 Kitin tinh sạch 18 16 Kitin thô 10 10 35 Kitin tinh sạch 22 18 Kitin thô 15 14 40 Kitin tinh sạch 30 8 Kitin thô 16 6 45 Kitin tinh sạch 10 6 Kitin thô 4 4 50 Kitin tinh sạch 4 4 Kitin thô 2 2
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 61 Phụ lục 02 pH Số lƣợng tế bào ( x 108 CFU/ ml) HD1 HD5 5,5 Kitin tinh sạch 8 4 Kitin thô 6 4 6,0 Kitin tinh sạch 12 8 Kitin thô 8 4 6,5 Kitin tinh sạch 16 10 Kitin thô 10 8 7,0 Kitin tinh sạch 18 14 Kitin thô 14 10 7,5 Kitin tinh sạch 10 16 Kitin thô 8 12 8,0 Kitin tinh sạch 6 6 Kitin thô 4 4
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 62
Phụ lục 03
Nồng độ cơ chất (%) Hoạt tính enzym (mm)
HD1 HD5 5‰ Kitin tinh sạch 24 20 Kitin thô 22 18 10‰ Kitin tinh sạch 30 30 Kitin thô 24 26 15‰ Kitin tinh sạch 36 34 Kitin thô 28 28 20‰ Kitin tinh sạch 34 34 Kitin thô 28 28 25‰ Kitin tinh sạch 34 34 Kitin thô 28 26
Bảng 12:Số lƣợng tế bào của các chủng nghiên cứu trong các nồng độ cơ chất khác nhau
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 63
Phụ lục 04