2.1.3.1 Môi trường phân lập
Môi trƣờng thạch thƣờng (NA). Cao thịt 3g Pepton 10g Thạch 18g Nƣớc cất 1000ml pH: 7,0. Khử trùng 1210 C trong 30 phút.
2.1.3.2 Môi trường giữ giống
Môi trƣờng LB Cao nấm men 3g Pepton 10g Thạch 18g Nƣớc cất 1000ml pH: 7,0. Khử trùng 1210 C trong 30 phút.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 28 Môi trƣờng cơ chất Kitin: 5,0g Pepton: 7,0g Thạch: 18 g Cao nấm men : 1,0g Nƣớc cất 1000ml pH:7,0. Khử trùng 1210 C trong 30 phút.
=>Pha tương tự môi trường cơ chất với 2 trường hợp kitin tinh sạch và kitin thô.
2.1.3.4 Môi trường nuôi cấy lắc
Môi trường 1 Kitin: 5,0g Pepton: 7,0g Cao nấm men : 1,0g Nƣớc cất: 1000ml pH: 7,0. Khử trùng 1210 C trong 30 phút. Môi trường 2 ZnSO4: 1,0 g (NH4)2 SO4: 1,0 g KH2PO4: 1,0g Kitin: 2 g KCL: 0,5 g MgSO4. 7H2O: 0,5 g FeSO4: 0,01g H2O: 1000ml pH = 7,0 Khử trùng 1210 C trong 30 phút.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 29
Môi trường 3
Cao men 0,5 g (NH4)2 SO4: 1,0 g KH2PO4: 1,36g Kitin: 10 g
MgSO4: 0,3 g Nƣớc cất: 1000ml pH = 7,0
Khử trùng 1210 C trong 30 phút.
=>Chú ý luôn pha song song kitin tinh chế và kitin thô cho mỗi loại môi trường.
2.1.3.5Môi trường Czapek nuôi cấy nấm
NaNO3: 2,0 g Đƣờng kính: 30 g KH2PO4: 1,0g FeSO4: 0,05g KCL: 0,5 g MgSO4: 0,5 g Nƣớc máy: 1000ml
pH = 7,0
2.1.3.6 Các dung dịch hoá chất sử dụng trong nhuộm Gram
* Tím kết tinh:
Dung dịch a: Tím kết tinh Cồn 95%
Dung dịch b: Amonium oxalate
2,0g. 20ml 0,8g
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 30 Nƣớc cất 80ml
Trộn dung dịch a vào dung dịch b. Để lắng 24h, lọc với 2 lớp giấy lọc trƣớc khi dung
* Lugol
I2: 1g KI: 2g
Nƣớc cất: 300ml
Nghiền 2 hoá chất này và thêm nƣớc từ từ cho đến khi tan hết.
* Dung dịch tẩy màu
Cồn iốt: Cồn 95% 100ml Iốt 0,1g
* Thuốc nhuộm bổ sung Safranin
Safranin: 0,25g Cồn 95%: 10ml Nƣớc cất: 90ml 2.2 PHƢƠNG PHÁP 2.2.1 Phân lập vi khuẩn * Xác định số lượng khuẩn lạc:
Từ các mẫu đất thu đƣợc, tiến hành pha loãng tới nồng độ 10-6. Lấy 0,1 ml dịch pha loãng ở mỗi nồng độ đem cấy trang trên đĩa thạch NA đã đƣợc khử trùng. Nuôi cấy tại nhiệt độ 350 C sau 24 giờ thu các khuẩn lạc.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 31
* Tinh sạch
Sau khi đếm xác định số lƣợng, quan sát mô tả hình thái các khuẩn lạc hiếu khí, từ mỗi khuẩn lạc đem tinh sạch bằng phƣơng pháp cấy zia trên đĩa thạch NA, nuôi cấy tại nhiệt độ 350 C sau 24 giờ thu các khuẩn lạc đã tinh sạch.
* Giữ giống
Từ các chủng vi khuẩn thuần khiết đem cấy zia trong các ống thạch nghiêng có môi trƣờng LB, nuôi cấy tại nhiệt độ 350
C sau 24 giờ rồi mang giữ giống ở trong tủ lạnh.
2.2.2 Xác định khả năng sinh kitinaza.
* Phương pháp đặt thỏi thạch.
Từ các chủng đã tinh sạch, dùng khoan thạch để khoan lấy các thỏi thạch. Sau đó đặt các thỏi thạch ra các đĩa Petriđổ môi trƣờng cơ chất thƣơng ứng. Đặt vào tủ lạnh 6- 8h. Đem nuôi cấy tại nhiệt độ 350C trong 24 giờ. Sử dụng Lugol xác định vòng phân giải.
* Khả năng sinh kitinaza xác định theo công thức
H = D – d ( mm) H : Hoạt tính enzyme
D: Tổng đƣờng kính vòng phân giải và thỏi thạch d: Đƣờng kính thỏi thạch
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 32 Vi khuẩn nuôi cấy lắc ở 180 vòng / phút tại nhiệt độ 350 C sau 24 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng / phút trong 15 phút. Thu dịch enzym nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trong đĩa Petri chứa môi trƣờng cơ chất. Đặt các đĩa Petri vào tủ lạnh 6- 8h sau đó nhấc ra đặt vào tủ ấm nuôi cấy, sau 24h xác định hoạt tính bằng thuốc thửLugol đo vòng phân giải.
* Hoạt tính kitinaza xác định theo công thức
H = D – d ( mm) H : Hoạt tính enzyme
D: Tổng đƣờng kính vòng phân giải và thỏi thạch d: Đƣờng kính lỗ thạch
2.2.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào
Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc 180 vòng/ phút ở các điều kịên thích hợp. Dịch nuôi cấy đƣợc pha loãng tới 10-6. Hút 0,5ml dịch pha loãng cấy trang trên đĩa thạch môi trƣờng, cho vào tủ ấm 350
C. Sau 1 ngày đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên đĩa.
Công thức tính số lượng tế bào:
Số lƣợng tế bào = a x 1/K x 1/V
a: số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa K: nồng độ pha loãng
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 33
2.2.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh kitinaza của các chủng lựa chọn. các chủng lựa chọn.
Lƣu ý: tiến hành thí nghiệm song song 2 trƣờng hợp tƣơng tự giữa kitin thô và kitin tinh chế.
2.2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ.
Bằng phƣơng pháp nhỏ dịch, các chủng lựa chọn đƣợc nuôi cấy tại các nhiệt độ khác nhau 250
C, 300 C, 350 C, 400 C, 450 C và 500Ctrong 24 giờ. Xác định và so sánh đƣờng kính vòng phân giải tại các nhiệt độ đó.
2.2.4.2 Ảnh hưởng của pH.
Bằng phƣơng pháp nhỏ dịch, các chủng lựa chọn đƣợc nuôi cấy tại các pH khác nhau 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 trong 24 giờ. Xác định và đo đƣờng kính vòng phân giải tại các pH đó.
2.2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất.
Bằng phƣơng pháp nhỏ dịch, các chủng lựa chọn đƣợc nuôi cấy tại các nồng độ cơ chất khác nhau 5‰, 10‰, 15‰,20‰, 25‰ trong 24 giờ. Xác định và đo đƣờng kính vòng phân giải tại các nồng độ cơ chất đó.
2.2.4.4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính enzym.
Dịch enzym thô đƣợc bảo quản trong tủ lạnh 40C trong 4 tuần. Cứ sau 1 tuần lại tiến hành thử hoạt tính của enzym theo phƣơng pháp nhỏ dịch tại nhiệt độ 350 C. Sau 24 h xác định và đo đƣờng kính vòng phân giải.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 34
2.2.5Xác định khả năng kháng nấm.
Cấy chủng nấm gây bệnh trong môi trƣờng Czapek thạch, xác định khả năng kháng nấm của các chủng lựa chọn theo phƣơng pháp nhỏ dịch. Nếu vi khuẩn kháng nấm sẽ xuất hiện vòng kháng.
* Hoạt tính kháng nấm xác định theo công thức
H = D – d ( mm)
H : Hoạt tính kháng nấm
D: Tổng đƣờng kính vòng phân giải và thỏi thạch d: Đƣờng kính lỗ thạch
2.2.6 Một số đặc tính sinh học của các chủng lựa chọn
* Hình thái khuẩn lạc
Lấy 1 ít sinh khối đã tinh sạch và pha loãng, nhỏ vào giọt nƣớc cất trên lam kính. Cố định trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm Safranin trong 1 phút, quan sát dƣới vật kính dầu 100X.
* Hình dạng khuẩn lạc
Lấy 1 ít sinh khối đã tinh sạch, pha loãng, cấy trang trên môi trƣờng NA. Sau 24 giờ quan sát và mô tả hình thái.
* Nhuộm Gram
- Chuẩn bị vết bôi: lấy 1 ít sinh khối chủng vi khuẩn hoà vào giọt nƣớc cất ở giữa phiến kính.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 35 - Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút.
- Nhỏ 1 giọt Lugol trong 1 phút.
- Tẩy màu: rửa vết bôi bằng cồn 30 giây. - Rửa sạch bằng nƣớc cất, hong khô.
- Nhuộm Safranin trong 1 phút, rử nƣớc hong khô. - Quan sát vật kính dầu 100X.
=> Xác định kết quả: nếu Gram dƣơng thành tế bào bắt màu tím, Gram âm thành tế bào bắt màu hồng.
* Khả năng sinh bào tử
Pha loãng khuẩn lạc vào các ống nghiệm, đun cách thuỷ ở 800
C trong 10 phút. Hút 50 μl dịch cấy trang trên môi trƣờng NA, nuôi cấy ở 350
C. Sau 24 giờ nếu trên đĩa thạch khuẩn lạc mọc chứng tỏ chủng có khả năng hình thành nội bào tử.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 36
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH KITINAZA
Từ mẫu đất thƣờng ở vùng đất trồng Ninh Giang - Hải Dƣơng không bổ sung nguồn kitin thu đƣợc 31 chủng vi khuẩn kí hiệu NG1- NG31. Qua sơ tuyển bằng phƣơng pháp đặt thỏi thạch với môi trƣờng cơ chất trong cả 2 trƣờng hợp kitin tinh sạch và kitin thô thu đƣợc 7 chủng có hoạt tính kitinaza. Kết quả bảng 01
Chủng vi khuẩn
Hoạt tính kitinaza (mm) Kitin tinh sạch Kitin thô
NG1 25 20 NG2 22 19 NG3 20 16 NG4 19 16 NG5 17 15 NG6 13 10 NG7 9 6
Bảng 1: Hoạt tính kitinaza của các chủng ở mẫu đất thƣờng
Từ mẫu đất đƣợc bổ sung nguồn kitin ở vùng đất trồng Ninh Giang - Hải Dƣơng theo phƣơng pháp làm giàu thu đƣợc 35 chủng vi khuẩn trên môi trƣờng phân lập NA. Bằng phƣơng pháp đặt thỏi thạch với môi trƣờng cơ chất trong cả 2 trƣờng hợp kitin tinh sạch và kitin thô thu đƣợc 11 chủng có hoạt tính kitinaza. Kết quả bảng 02
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 37
Chủng vi khuẩn
Hoạt tính kitinaza H (mm)
Kitin tinh sạch Kitin thô
HD1 29 23 HD2 25 20 HD3 23 18 HD4 24 18 HD5 27 22 HD6 22 15 HD7 21 17 HD8 22 16 HD9 20 17 HD10 19 15 HD11 20 17
Bảng 2: Hoạt tính kitinaza của các chủng ở mẫu đất làm giàu
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, trong cả hai trƣờng hợp làm giàu hay không làm giàu nguồn vi sinh vật trong đất là vô cùng phong phú. Tuy nhiên, với mẫu đất đƣợc bổ sung nguồn cơ chất kitin thì các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kitin đã tăng lên rõ rệt ( từ 07 lên 11 chủng). Thêm vào đó mật độ các chủng có khả năng phân giải kitin cũng tăng lên đáng kể ( cùng ở nồng độ 10-5
, mẫu đất thƣờng chủng NG1 đạt 5 khuẩn lạc / 1 đĩa Petri còn chủng HD1 đạt 12 khuẩn lạc/ 1 đĩa Petri) . Qua đây có thể khẳng định rằng, chúng ta hoàn toàn có thể tập trung để tăng nguồn vi khuẩn phân giải cơ chất nào đó trong đất theo cách bổ sung nguồn cơ chất đó.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 38 Nhƣ vậy đất là nguồn nguyên liệu điều chế enzym rất rẻ tiền, điều đó mang lại ý nghĩa về mặt kinh tế trong nghiên cứu khoa học.
Với mẫu đất làm giàu, trong 11 chủng thu đƣợc 2 chủng có khả năng phân giải kitin mạnh nhất là HD1 và HD5. Tôi tiến hành nghiên cứu các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất và thời gian bảo quản ảnh hƣởng tới hoạt tính kitinaza của 2 chủng này.
Nhƣngđể chắc chắn enzym đƣợc sinh của chủng HD1 và HD5 là kitinaza, bằng phƣơng pháp nhỏ dịchvà sử dụng nƣớc cất đối chứng. Kết quả thu đƣợc lỗ thạch chứa enzym của chủng HD1 và HD5 tạo vòng phân giải, nƣớc cất không tạo vòng với thuốc thử Lugol. Qua đó kết luận rằng chắc chắn enzym đƣợc đƣợc sinh từ chủng HD1, HD5 và các chủng còn lại là kitinaza. Kết quả thể hiện ở hình6
Hình.6a: Phân giải kitin của chủng HD1
Hình. 6b: Phân giải kitin của chủng HD5
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 39
3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH
KITINAZA CỦA CÁC CHỦNG LỰA CHỌN
3.2.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy
Trong lên men công nghiệp, sau khi đã lựa chọn đƣợc chủng có hoạt tính cao, chúng ta cần phải lựa chọn môi trƣờng thích hợp nhất để duy trì năng suất sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn cao nhất. Môi trƣờng thích hợp đó phải đảm bảo chủng nghiên cứu sinh trƣởng tốt nhất và các sản phẩm mong muốn đƣợc sinh ra với hiệu suất cao nhất.
Tiến hành nuôi cấy lắc 2 chủng HD1 và HD5 trên 3 loại môi trƣờng 1,2,3 trong cả hai trƣờng hợp kitin tinh sạch và kitin thô. Sau 24giờ kiểm tra hoạt tính kitinaza theo phƣơng pháp nhỏ dịch nhằm chọn lọc đƣợc môi trƣờng nuôi cấy thích hợp nhất. Kết quả thể hiện bảng3
Bảng 3: Các chủng nghiên cứu nuôi cấy trên các loại môi trƣờng Môi trƣờng Hoạt tính kitinaza
HD1 HD5
Môi trƣờng 1 Kitin tinh sạch 31 29
Kitin thô 27 26
Môi trƣờng 2 Kitin tinh sạch 19 15
Kitin thô 14 11
Môi trƣờng 3 Kitin tinh sạch 23 21
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 40 Bảng kết quả trên cho thấy, cả 2 chủng đều sinh trƣởng trên cả 3 loại môi trƣờng trong cả hai trƣờng hợp kitin tinh sạch và kitin thô. Tuy nhiên, trong 3 môi trƣờng thì cả hai chủng HD1 và HD5 đều thể hiện hoạt tính kitinaza mạnh nhất trên môi trƣờng 1 sau đó đến môi trƣờng 3. Điều này cho thấy kitin chính là chất cảm ứng kích thích vi khuẩn sản sinh kitinaza để phân giải cơ chất. Nhƣ vậy, môi trƣờng 1 là môi trƣờng thích hợp nhất cho khả năng sinh kitinaza và là môi trƣờng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nuôi cấy 2 chủng lựa chọn tại các nhiệt độ khác nhau 250
C, 300 C, 350 C, 400 C, 450 C và 500 C. Bằng phƣơng pháp nhỏ dịch xác định khả năng sinh kitinaza của 2 chủng HD1 và HD5với cơ chất kitin tinh sạch và kitin thô, kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 4.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 41 Nhiệt độ 0 C Hoạt tính enzym (mm)
HD1 HD5 25 Kitin tinh sạch 26 23 Kitin thô 19 15 30 Kitin tinh sạch 27 25 Kitin thô 21 21 35 Kitin tinh sạch 29 27 Kitin thô 23 22 40 Kitin tinh sạch 31 21 Kitin thô 26 18 45 Kitin tinh sạch 25 21 Kitin thô 21 17 50 Kitin tinh sạch 19 17 Kitin thô 15 13
Bảng 4: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dƣới ảnh hƣởng của nhiệt độ
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 42 Cùng với phƣơng pháp nhỏ dịch xác định hoạt tính kitinaza, tôi tiến hành xác định số lƣợng tế bào của 2 chủng HD1 và HD5. Kết quả thu đƣợc ở bảng phụ 01 và hình 7
Hình 7: Khả năng sinh trƣởng của các chủng lựa chọn
Từ kết quả thu đƣợc ta thấy,trong khoảng nhiệt độ từ 250 C- 500 C cả 2 chủng đều hoạt động tốt. Chủng HD1 khả năng sinh tổng hợp kitinaza mạnh ở khoảng nhiệt độ từ( 350
C – 400 C), giảm dần từ 450 C- 500 và nhiệt độ tối thích là 400 C trên đồng thời cả hai dạng cơ chất kitin thô và kitin tinh sạch. Cũng trên cả hai loại cơ chất nhƣ chủng HD1, chủng HD5sinh tổng hợpkitinaza mạnh ở khoảng nhiệt độ từ ( 300 C – 350 C), nhiệt độ tối thích là 350 C và hoạt tính giảm dần từ 400 C- 500.
0 5 10 15 20 25 30 35 HD1 kitin tinh sạch
HD1 kitin thô HD5 kitin tinh
sạch HD5 kitin thô 25 30 35 40 45 50 S ố lƣ ợn g t ế bà o( x 10 8 CFU / m l)
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 43 So sánh kết quả thu đƣợc qua hai phƣơng pháp là không khác nhau. Nhƣ vậy dù phƣơng pháp nghiên cứu có đơn giản nhƣng kết quả thu đƣợc vẫn chính xác.
Hơn nữa, khả năng sinh kitinaza trên môi trƣờng cơ chất thô có yếu hơn so với môi trƣờng cơ chất tinh sạch. Tuy nhiên, vẫn phản ánh đúng giới hạn nhiệt độvà nhiệt độ tối ƣu cho khă năng sinh enzym ở mỗi chủng. Nhƣ vậy có thể thấy rằng, chúng ta hoàn toàn có thể thay thế kitin thô bằng kitin tinh chế trong việc định tính enzym để xác định yếu tố nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt tính của chúng.
Nhƣ vậy, kết quả thu đƣợc phù hợp với thực tế nhiệt độ canh tác ở khu vực phía Bắc của Việt Nam nói chung và địa bàn huyện Ninh Giang nói riêng. Từ đó thấy rằng, trong đất trồng trọt luôn chứa một lƣợng lớn enzym có lợi cho mục đích bảo vệ cây trồng của con nguời.