* Hình thái khuẩn lạc
Lấy 1 ít sinh khối đã tinh sạch và pha loãng, nhỏ vào giọt nƣớc cất trên lam kính. Cố định trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm Safranin trong 1 phút, quan sát dƣới vật kính dầu 100X.
* Hình dạng khuẩn lạc
Lấy 1 ít sinh khối đã tinh sạch, pha loãng, cấy trang trên môi trƣờng NA. Sau 24 giờ quan sát và mô tả hình thái.
* Nhuộm Gram
- Chuẩn bị vết bôi: lấy 1 ít sinh khối chủng vi khuẩn hoà vào giọt nƣớc cất ở giữa phiến kính.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 35 - Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút.
- Nhỏ 1 giọt Lugol trong 1 phút.
- Tẩy màu: rửa vết bôi bằng cồn 30 giây. - Rửa sạch bằng nƣớc cất, hong khô.
- Nhuộm Safranin trong 1 phút, rử nƣớc hong khô. - Quan sát vật kính dầu 100X.
=> Xác định kết quả: nếu Gram dƣơng thành tế bào bắt màu tím, Gram âm thành tế bào bắt màu hồng.
* Khả năng sinh bào tử
Pha loãng khuẩn lạc vào các ống nghiệm, đun cách thuỷ ở 800
C trong 10 phút. Hút 50 μl dịch cấy trang trên môi trƣờng NA, nuôi cấy ở 350
C. Sau 24 giờ nếu trên đĩa thạch khuẩn lạc mọc chứng tỏ chủng có khả năng hình thành nội bào tử.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 36
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH KITINAZA
Từ mẫu đất thƣờng ở vùng đất trồng Ninh Giang - Hải Dƣơng không bổ sung nguồn kitin thu đƣợc 31 chủng vi khuẩn kí hiệu NG1- NG31. Qua sơ tuyển bằng phƣơng pháp đặt thỏi thạch với môi trƣờng cơ chất trong cả 2 trƣờng hợp kitin tinh sạch và kitin thô thu đƣợc 7 chủng có hoạt tính kitinaza. Kết quả bảng 01
Chủng vi khuẩn
Hoạt tính kitinaza (mm) Kitin tinh sạch Kitin thô
NG1 25 20 NG2 22 19 NG3 20 16 NG4 19 16 NG5 17 15 NG6 13 10 NG7 9 6
Bảng 1: Hoạt tính kitinaza của các chủng ở mẫu đất thƣờng
Từ mẫu đất đƣợc bổ sung nguồn kitin ở vùng đất trồng Ninh Giang - Hải Dƣơng theo phƣơng pháp làm giàu thu đƣợc 35 chủng vi khuẩn trên môi trƣờng phân lập NA. Bằng phƣơng pháp đặt thỏi thạch với môi trƣờng cơ chất trong cả 2 trƣờng hợp kitin tinh sạch và kitin thô thu đƣợc 11 chủng có hoạt tính kitinaza. Kết quả bảng 02
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 37
Chủng vi khuẩn
Hoạt tính kitinaza H (mm)
Kitin tinh sạch Kitin thô
HD1 29 23 HD2 25 20 HD3 23 18 HD4 24 18 HD5 27 22 HD6 22 15 HD7 21 17 HD8 22 16 HD9 20 17 HD10 19 15 HD11 20 17
Bảng 2: Hoạt tính kitinaza của các chủng ở mẫu đất làm giàu
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, trong cả hai trƣờng hợp làm giàu hay không làm giàu nguồn vi sinh vật trong đất là vô cùng phong phú. Tuy nhiên, với mẫu đất đƣợc bổ sung nguồn cơ chất kitin thì các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kitin đã tăng lên rõ rệt ( từ 07 lên 11 chủng). Thêm vào đó mật độ các chủng có khả năng phân giải kitin cũng tăng lên đáng kể ( cùng ở nồng độ 10-5
, mẫu đất thƣờng chủng NG1 đạt 5 khuẩn lạc / 1 đĩa Petri còn chủng HD1 đạt 12 khuẩn lạc/ 1 đĩa Petri) . Qua đây có thể khẳng định rằng, chúng ta hoàn toàn có thể tập trung để tăng nguồn vi khuẩn phân giải cơ chất nào đó trong đất theo cách bổ sung nguồn cơ chất đó. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 38 Nhƣ vậy đất là nguồn nguyên liệu điều chế enzym rất rẻ tiền, điều đó mang lại ý nghĩa về mặt kinh tế trong nghiên cứu khoa học.
Với mẫu đất làm giàu, trong 11 chủng thu đƣợc 2 chủng có khả năng phân giải kitin mạnh nhất là HD1 và HD5. Tôi tiến hành nghiên cứu các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất và thời gian bảo quản ảnh hƣởng tới hoạt tính kitinaza của 2 chủng này.
Nhƣngđể chắc chắn enzym đƣợc sinh của chủng HD1 và HD5 là kitinaza, bằng phƣơng pháp nhỏ dịchvà sử dụng nƣớc cất đối chứng. Kết quả thu đƣợc lỗ thạch chứa enzym của chủng HD1 và HD5 tạo vòng phân giải, nƣớc cất không tạo vòng với thuốc thử Lugol. Qua đó kết luận rằng chắc chắn enzym đƣợc đƣợc sinh từ chủng HD1, HD5 và các chủng còn lại là kitinaza. Kết quả thể hiện ở hình6
Hình.6a: Phân giải kitin của chủng HD1
Hình. 6b: Phân giải kitin của chủng HD5
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 39
3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH
KITINAZA CỦA CÁC CHỦNG LỰA CHỌN
3.2.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy
Trong lên men công nghiệp, sau khi đã lựa chọn đƣợc chủng có hoạt tính cao, chúng ta cần phải lựa chọn môi trƣờng thích hợp nhất để duy trì năng suất sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn cao nhất. Môi trƣờng thích hợp đó phải đảm bảo chủng nghiên cứu sinh trƣởng tốt nhất và các sản phẩm mong muốn đƣợc sinh ra với hiệu suất cao nhất.
Tiến hành nuôi cấy lắc 2 chủng HD1 và HD5 trên 3 loại môi trƣờng 1,2,3 trong cả hai trƣờng hợp kitin tinh sạch và kitin thô. Sau 24giờ kiểm tra hoạt tính kitinaza theo phƣơng pháp nhỏ dịch nhằm chọn lọc đƣợc môi trƣờng nuôi cấy thích hợp nhất. Kết quả thể hiện bảng3
Bảng 3: Các chủng nghiên cứu nuôi cấy trên các loại môi trƣờng Môi trƣờng Hoạt tính kitinaza
HD1 HD5
Môi trƣờng 1 Kitin tinh sạch 31 29
Kitin thô 27 26
Môi trƣờng 2 Kitin tinh sạch 19 15
Kitin thô 14 11
Môi trƣờng 3 Kitin tinh sạch 23 21
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 40 Bảng kết quả trên cho thấy, cả 2 chủng đều sinh trƣởng trên cả 3 loại môi trƣờng trong cả hai trƣờng hợp kitin tinh sạch và kitin thô. Tuy nhiên, trong 3 môi trƣờng thì cả hai chủng HD1 và HD5 đều thể hiện hoạt tính kitinaza mạnh nhất trên môi trƣờng 1 sau đó đến môi trƣờng 3. Điều này cho thấy kitin chính là chất cảm ứng kích thích vi khuẩn sản sinh kitinaza để phân giải cơ chất. Nhƣ vậy, môi trƣờng 1 là môi trƣờng thích hợp nhất cho khả năng sinh kitinaza và là môi trƣờng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nuôi cấy 2 chủng lựa chọn tại các nhiệt độ khác nhau 250
C, 300 C, 350 C, 400 C, 450 C và 500 C. Bằng phƣơng pháp nhỏ dịch xác định khả năng sinh kitinaza của 2 chủng HD1 và HD5với cơ chất kitin tinh sạch và kitin thô, kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 4.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 41 Nhiệt độ 0 C Hoạt tính enzym (mm)
HD1 HD5 25 Kitin tinh sạch 26 23 Kitin thô 19 15 30 Kitin tinh sạch 27 25 Kitin thô 21 21 35 Kitin tinh sạch 29 27 Kitin thô 23 22 40 Kitin tinh sạch 31 21 Kitin thô 26 18 45 Kitin tinh sạch 25 21 Kitin thô 21 17 50 Kitin tinh sạch 19 17 Kitin thô 15 13
Bảng 4: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dƣới ảnh hƣởng của nhiệt độ
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 42 Cùng với phƣơng pháp nhỏ dịch xác định hoạt tính kitinaza, tôi tiến hành xác định số lƣợng tế bào của 2 chủng HD1 và HD5. Kết quả thu đƣợc ở bảng phụ 01 và hình 7
Hình 7: Khả năng sinh trƣởng của các chủng lựa chọn
Từ kết quả thu đƣợc ta thấy,trong khoảng nhiệt độ từ 250 C- 500 C cả 2 chủng đều hoạt động tốt. Chủng HD1 khả năng sinh tổng hợp kitinaza mạnh ở khoảng nhiệt độ từ( 350
C – 400 C), giảm dần từ 450 C- 500 và nhiệt độ tối thích là 400 C trên đồng thời cả hai dạng cơ chất kitin thô và kitin tinh sạch. Cũng trên cả hai loại cơ chất nhƣ chủng HD1, chủng HD5sinh tổng hợpkitinaza mạnh ở khoảng nhiệt độ từ ( 300 C – 350 C), nhiệt độ tối thích là 350 C và hoạt tính giảm dần từ 400 C- 500.
0 5 10 15 20 25 30 35 HD1 kitin tinh sạch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
HD1 kitin thô HD5 kitin tinh
sạch HD5 kitin thô 25 30 35 40 45 50 S ố lƣ ợn g t ế bà o( x 10 8 CFU / m l)
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 43 So sánh kết quả thu đƣợc qua hai phƣơng pháp là không khác nhau. Nhƣ vậy dù phƣơng pháp nghiên cứu có đơn giản nhƣng kết quả thu đƣợc vẫn chính xác.
Hơn nữa, khả năng sinh kitinaza trên môi trƣờng cơ chất thô có yếu hơn so với môi trƣờng cơ chất tinh sạch. Tuy nhiên, vẫn phản ánh đúng giới hạn nhiệt độvà nhiệt độ tối ƣu cho khă năng sinh enzym ở mỗi chủng. Nhƣ vậy có thể thấy rằng, chúng ta hoàn toàn có thể thay thế kitin thô bằng kitin tinh chế trong việc định tính enzym để xác định yếu tố nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt tính của chúng.
Nhƣ vậy, kết quả thu đƣợc phù hợp với thực tế nhiệt độ canh tác ở khu vực phía Bắc của Việt Nam nói chung và địa bàn huyện Ninh Giang nói riêng. Từ đó thấy rằng, trong đất trồng trọt luôn chứa một lƣợng lớn enzym có lợi cho mục đích bảo vệ cây trồng của con nguời.
3.2.3 Ảnh hưởng của pH
Nuôi cấy 2 chủng lựa chọn tại các pH khác nhau 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0. Bằng phƣơng pháp nhỏ dịch xác định hoạt tính phân giải kitin của 2 chủng HD1 và HD5 với cơ chất kitin tinh sạch và kitin thô. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 5.
pH Hoạt tính enzym (mm)
HD1 HD5
5,5 Kitin tinh sạch 21 19
Kitin thô 15 15
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 44 Kitin thô 16 16 6,5 Kitin tinh sạch 27 23 Kitin thô 20 22 7,0 Kitin tinh sạch 29 27 Kitin thô 23 22 7,5 Kitin tinh sạch 25 28 Kitin thô 21 24 8,0 Kitin tinh sạch 19 16 Kitin thô 27 17
Bảng 5: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dƣới ảnh hƣởng của pH
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 45 Cũng tại các pH khác nhau, tôi tiến hành xác định khả năng sinh trƣởng của 2 chủng trên 2 loại cơ chất trong môi trƣờng số 1. Với phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào , kết quả thu đƣợc thể hiện phụ lục 02 và hình 8
Hình 8: Khả năng sinh trƣởng của các chủng lựa chọn
Từ kết quả thu đƣợc ta thấy, pH ảnh hƣởng đến khả năng sinh kitinaza của 2 chủng nghiên cứu. Tại các pH khác nhau khả năng sinh enzym của chủng HD1 và HD5 là khác nhau. Chủng HD1 sinhkitinaza mạnh trong khoảng pH từ 6,5 – 7,5 và mạnh nhất tại pH = 7,0. Chủng HD5 tổng hợp kitinaza mạnh trong khoảng pH từ 6,5 – 7,5 và mạnh nhất tại pH = 7,5. Tại pH thấp ( 5,5) và cao (8,0) các chủng thể hiện hoạt tính giảm hẳn. pH thích hợp cho cả hai chủng là trung tính hoặc kiềm yếu. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
HD1 kitin tinh sạch HD1 kitin thô HD5 kitin tinh sạch HD5 kitin thô
5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 46 Hơn nữa, trên cả 2 loại cơ chất thô và cơ chất tinh sạch, về giới hạn và điểm tối ƣu của pH là giống nhau ở cả 2 chủng. Tuy nhiên, cũng giống nhƣ yếu tố nhiệt độ, cả 2 chủng đều thể hiện hoạt tính mạnh hơn đối với cơ chất tinh sạch. Kết quả đó có lẽ do cơ chất thô vì xử lí với HCL 5% chƣa loại bỏ đƣợc hết các yếu tố tạp chất trong nguồn thu kitin. Do dó, các yếu tố đó đóng vai trò nhƣ những chất ức chế hoạt tính của kitinaza.
Nhƣ vậy. để xác định hoạt tính kitinaza của các chủng vẫn có thể sử dụng cơ chất thô thay cho cơ chất tinh sạch nhằm giảm chi phí.
Thêm vào đó, giữa phƣơng pháp nhỏ dịch và phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào để chứng minh pH ảnh hƣởng đến khả năng sinh kitinza của 2 chủng nghiên cứu đều cho kết quả thống nhất.
3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Bằng phƣơng pháp nhỏ dịch, các chủng lựa chọn đƣợc nuôi cấy tại các nồng độ cơ chất khác nhau 5‰, 10‰, 15‰, 20‰, 25‰ trong 24 giờ. Kết quả thu đƣợc thể hiện bảng 6.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 47 Nồng độ cơ chất (%) Hoạt tính enzym (mm)
HD1 HD5 5‰ Kitin tinh sạch 29 27 Kitin thô 23 22 10‰ Kitin tinh sạch 32 30 Kitin thô 25 24 15‰ Kitin tinh sạch 35 34 Kitin thô 29 27 20‰ Kitin tinh sạch 33 34 Kitin thô 28 27 25‰ Kitin tinh sạch 34 33 Kitin thô 29 26
Bảng 6: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dƣới ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Theo phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào, 2 chủng nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trong các nồng độ khác nhau từ 5%- 25%. Kết quả thu đƣợc phụ lục 03 và hình 9.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 48 Hình 9: Khả năng sinh trƣởng của các chủng lựa chọn
Từ kết quả trên thấy rằng, trên cả hai loại cơ chất, chủng HD1 hoạt tính kitinaza tăng mạnh từ nồng độ cơ chất 5‰ - 15‰ và tối ƣu 15‰. Chủng HD5 cũng trùng khớp với chủng HD1. Nếu nồng độ cơ chất vƣợt quá 15‰ hoạt tính enzym không tăng nữa. Kết quả này đúng với cơ sở lý thuyết, mỗi enzym có cấu hình không gian trung tâm hoạt động tƣơng thích với mỗi loại cơ chất nhất định, một khi trung tâm hoạt động đã đƣợc lấp đầy cơ chất hoạt tính enzym không tăng nữa cho dù tăng nồng độ cơ chất. Sau phản ứng, kitinaza giải phóng là nguyên vẹn nên trở lạixúc tác cho phản ứng mới, vì vậy hoạt tính kitinaza tối ƣu ở nồng độ cơ chất 15‰và hầu nhƣ không giảm khi tăng nồng độ cơ chất.
So sánh giữa cơ chất tinh với cơ chất thô, kết quả tƣơng thích với các điều kiện nuôi cấy khác nhƣ pH và nhiệt độ. Hoạt tính kitinaza luôn mạnh hơn ở cơ chất tinh sạch, nhƣng về giới hạn hoạt động và điểm tối ƣu luôn ổn định và giống nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0 5 10 15 20 25 30 35 40
HD1 kitin tinh sạch HD1 kitin thô HD5 kitin tinh sạch HD5 kitin thô
5‰ 10‰ 15‰ 20‰ 25‰ Số lư ợ n g tế b ào ( x 1 0 8 CF U / ml)
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 49 Cũng giống nhƣ 2 loại cơ chất, cho dù sử dụng hai phƣơng pháp khác nhau để xác định điều kiện sinh kitinaza thì kết quả không thay đổi.
3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản
Sau 1 ngày nuôi cấy lắc, đem li tâm thu dịch enzym bảo quản ở 40
C. Cứ sau 1 tuần tiến hành thử hoạt tính enzym theo phƣơng pháp nhỏ dịch. Kết quả thu đƣợc ở bảng 8.
Thời gian Hoạt tính kitinaza ( mm)
HD1 HD5
1 tuần Kitin tinh sạch 24 25
Kitin thô 20 21
2 tuần Kitin tinh sạch 23 24
Kitin thô 20 21
3 tuần Kitin tinh sạch 22 22
Kitin thô 19 19
4 tuần Kitin tinh sạch 22 21
Kitin thô 19 18
Bảng 7: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dƣới ảnh hƣởng của thời gian bảo quản
Nhƣ vậy, thời gian bảo quản có ảnh hƣởng không đáng kể đến hoạt tính enzym. Tính ổn định của enzym sau nhiều tuần bảo quản tạo ra một chế phẩm sinh học đảm bảo.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 50 Từ các kết quả nghiên cứu trên thấy rằng, 2 chủng HD1 và HD5 đƣợc phân lập từ mẫu đất có bổ sung nguồn cơ chất ( kitin) đều hoạt động mạnh trong dải nhiệt độ từ 30- 400 C, dải pH từ 6,5- 7,5 và nồng độ cơ chất 5‰ - 15‰. Tuy trong tiến trình