2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Mẫu cá cảnh biển bệnh
Quan sát các dấu hiệu bệnh lý
Kiểm tra các chỉ tiêu
Ký sinh trùng Vi khuẩn Nấm
Phân lập vi khuẩn trên mơi trường NA bổ sung 3% NaCl và TCBS
Chọn khuẩn lạc ưu thế
Nuơi cấy thuần trên mơi trường TCBS
Giữ giống trong mơi trường thạch nghiêng NA cĩ bổ sung 3% NaCl
Xác định hình thái và kiểm tra Bảo quản giống trong Glycerol ở -70O C các đặc tính sinh lý, sinh hĩa
Tiến hành xác định độc lực của vi khuẩn và định danh vi khuẩn gây bệnh
Xác định chỉ số LD50
Lập kháng sinh đồ
Thử nghiệm trên dịch chiết thơ của một số loại thực vật
2.4.2 Phƣơng pháp thu mẫu và phân lập các tác nhân gây bệnh
Tổng số 20 cá thể cá cảnh biển từ 3 đợt nhận mẫu vào khoảng tháng 2/2013 được vận chuyển từ Khu du lịch Vinpearl đến Phịng thí nghiệm Vi sinh, trường Đại học Nha Trang trong các túi nylon cĩ bơm ơxy với trạng thái lờ đờ cùng biểu hiện xung huyết nhẹ đến nặng trên thân. Các thơng số về nguồn cá, kỹ thuật nuơi, quản lý hồ nuơi và chế độ chăm sĩc cũng như những dấu hiệu lâm sàng được ghi nhận cụ thể từ người cung cấp cá.
Cá bệnh nhận về được đặt lên khay sạch, quan sát và ghi nhận lại tất cả các biểu hiện bên ngồi như: trạng thái, màu sắc, da, vây, mắt,… Sau đĩ, các mẫu cá bệnh sẽ được kiểm tra lần lượt các chỉ tiêu về ký sinh trùng, nấm và vi khuẩn.
2.4.2.1 Kiểm tra ký sinh trùng
Cá bệnh được kiểm tra ký sinh trùng dựa theo mơ tả của Noga (2010). Ngoại ký sinh được kiểm tra bằng cách sử dụng mũi dao đã tiệt trùng thu lớp nhớt trên thân cá chà lên bề mặt lam kính sạch và đem quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phĩng đại 40X; mặt khác thu nhận vây lưng, vây đuơi và vây bụng cho vào đĩa petri sạch cĩ chứa sẵn nước muối sinh lý rồi quan sát dưới kính hiển vi soi nổi. Sau khi đã tiến hành phân lập vi khuẩn trong nội tạng, thận, gan, ruột, dạ dày và mang cá sẽ được thu nhận và cho vào nước muối sinh lý để kiểm tra hệ nội ký sinh.
Phương pháp định danh dựa vào đặc điểm hình thái và cấu tạo ký sinh trùng theo phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng trên cá của Hà Ký (1992) và Đỗ Thị Hịa và cs. (2008).
2.4.2.2 Kiểm tra nấm
Dùng tăm bơng vơ trùng tiến hành lấy mẫu trên tồn bộ bề mặt ngồi của cá và trang đều lên mơi trường SDA cĩ bổ sung Chloramphenicol (0,05 g/l) để hạn chế tạp khuẩn, ủ ở nhiệt độ phịng trong 4 - 5 ngày để kiểm tra sự phát triển của nấm. Quan sát các khuẩn lạc nấm mốc và nấm men (nếu cĩ). Sau đĩ, đem soi kính hiển vi để quan sát hình thái.
2.4.2.3 Phƣơng pháp phân lập, xác định hình thái và các đặc tính sinh lý, sinh hĩa của vi khuẩn
a. Phân lập vi khuẩn
Dùng que cấy vơ trùng lấy mẫu tại những vết xung huyết trên thân cấy lên mơi trường NA cĩ bổ sung 3% NaCl và mơi trường TCBS, ủ trong tủ ấm 28O
C trong 24 ± 2h nhằm phân lập nguồn vi khuẩn tại vị trí tổn thương.
Trước khi phân lập hệ nội vi khuẩn, rửa sạch cá trong dung dịch nước muối sinh lý vơ trùng hoặc cồn 70% và lau sạch nhằm loại bỏ hệ ngoại vi khuẩn cĩ thể gây sai sĩt trong thí nghiệm. Sau đĩ, dùng dao, panh và kéo đã tiệt trùng giải phẫu cá. Quan sát và ghi lại các dấu hiệu bệnh bên trong. Dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm trong gan và thận cấy ria tương tự như phân lập hệ vi khuẩn ngồi thân. Sau 24h ± 2h, quan sát màu sắc, hình thái, kích thước khuẩn lạc và tiếp tục tiến hành làm thuần cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần.
Hình 2.2. Hình ảnh giải phẫu cá và các vị trí nội quan
(http://www.biologyjunction.com/perch_dissection2.htm)
Các chủng vi khuẩn thuần sau khi phân lập được sẽ tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hĩa; mặt khác sẽ được lưu trữ ở -70OC trong glycerol để tiếp tục các thí nghiệm khác tiếp theo hoặc phục vụ cho các nghiên cứu sau này. Dạ dày Thận Gan Mang Lá lách Ruột Tim Bĩng hơi
b. Xác định hình thái, các đặc tính sinh lý và sinh hĩa của vi khuẩn
Dựa vào kết quả phân lập vi khuẩn, tiến hành xác định hình thái và tính chất bắt màu bằng phương pháp nhuộm Gram.
Đồng thời, các đặc điểm sinh lý (khả năng phát triển ở các nồng độ NaCl khác nhau: 0%, 3%, 5%, 6%, 8%, 10%; trong các mức nhiệt độ: 4OC, 42OC và khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí, khả năng di động) và sinh hĩa (khả năng lên men các loại đường: gồm lactose, glucose, sucrose, sinh H2S, sinh hơi, oxidase,…) được xác định sơ bộ nhằm phân nhĩm vi khuẩn.
2.4.3 Thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn và định danh chủng vi khuẩn đích gây bệnh đích gây bệnh
Các chủng vi khuẩn được chọn ngẫu nhiên trong các nhĩm vi khuẩn phân lập được từ cá cảnh biển bệnh với nhiều hình thái trên mơi trường TCBS, đặc điểm sinh lý và sinh hĩa khác nhau. Các chủng vi khuẩn được chọn sẽ đem nuơi tăng sinh trên mơi trường thạch nghiêng NA (cĩ bổ sung 3% NaCl) trong 24 ± 2h ở 28O
C. Trước khi tiêm cảm nhiễm, chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn bằng cách dùng que cấy lấy khuẩn lạc cho vào dung dịch 1% NaCl đã tiệt trùng để pha lỗng dịch vi khuẩn sao cho độ đục đạt mức McF là 0,5 (được đo bằng máy Densimat – Bio Mérieux, Pháp) sẽ tương đương khoảng 2,5×108 CFU/ml (đã được kiểm chứng tổng số vi khuẩn bằng phương pháp đếm đĩa).
Thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện tại phịng thí nghiệm Vi sinh, Viện CNSH&MT, trường Đại học Nha Trang trong hệ thống 4 bể kính cĩ thể tích 10 lít. Trước khi cảm nhiễm, nước biển sau khi lấy về trong các thùng lớn 60 lít sẽ được khử trùng bằng Chlorine (nồng độ 30ppm), đồng thời các bể nuơi cũng phải được khử trùng bằng Chlorine và rửa lại bằng nước sạch. Sau đĩ cho nước vào bể khoảng 8 lít/bể, lắp hệ thống sục khí liên tục trong 3 ngày để loại bỏ hết Chlorine cịn sĩt lại (vì dư lượng của Chlorine cĩ thể gây độc cho cá nên sau khi đã kiểm tra với bộ kit Cl chuyên dụng, nếu nhận thấy Chlorine vẫn cịn tồn tại trong nước thì cần trung hịa với Natri thiosulfate).
Cá được chọn tiến hành cảm nhiễm vi khuẩn là cá Khoang cổ đỏ (Tomato clownfish - Amphiprion frenatus) (Hình 2.3) cĩ trọng lượng khoảng 1,2 – 1,4g/con, khỏe mạnh được nuơi tại Viện Hải dương học Nha Trang. Cá cĩ màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt và khơng cĩ các tổn thương bên ngồi. Cá được bố trí và chia ngẫu nhiên 20 con/bể và để cá thích nghi khoảng 5 ngày cho quen dần với mơi trường nước thí nghiệm. Các nghiệm thức gồm: (1) lơ đối chứng, tiêm dung dịch 1% NaCl vơ trùng; (2 - 5) tiêm vi khuẩn ở nồng độ pha lỗng khác nhau. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 2 lần. Lưu ý, trước khi gây cảm nhiễm, lấy ngẫu nhiên 4 con cá từ 4 bể để kiểm tra ký sinh trùng và phân lập vi khuẩn từ khoang bụng để xác định cá hồn tồn khơng bị nhiễm bất cứ tác nhân nào trước cảm nhiễm.
Tiến hành tiêm vào khoang bụng của mỗi con cá 0,05ml dung dịch huyền phù vi khuẩn (Hình 2.3) với các nồng độ pha lỗng khác nhau từ 2.5x108 đến 106 CFU/ml. Theo dõi liên tục biểu hiện của cá trong khoảng 10 ngày; trong quá trình nuơi, nước trong bể được thay 20% mỗi ngày bằng nước biển đã xử lý và được kiểm tra lại các thơng số như: nhiệt độ, pH, NO2-, NH3/NH4+ nhằm đảm bảo khơng ảnh hưởng đến sức sống của cá. Những con cá cĩ dấu hiệu lờ đờ hoặc vừa mới chết trong khoảng 1 - 2h sẽ được thu nhận và tái kiểm tra hình thái khuẩn lạc vi khuẩn trên TCBS. Sau đĩ, xác định giá trị LD50 dựa trên tỷ lệ cá chếttheo phương pháp của Wardlaw (1985).
Sau khi xác định được chủng vi khuẩn đích gây bệnh, tính nhạy cảm với O129 (2,4-diamino-6,7-di-isopropyl-pteridine phosphate) và hoạt tính hemolysis (làm tan máu) trên mơi trường NA bổ sung 5% máu cừu, ủ ở 24 ± 2h, 28oC của vi khuẩn sẽ được xác định.
Thơng qua các đặc tính sinh lý, sinh hĩa đã xác định ở bước sàng lọc sơ bộ; kết hợp với sử dụng Kit API-20E (Bio Mérieux, Pháp) (Phụ lục 1) để định danh vi khuẩn mục tiêu bằng phần mềm của kit API-20E (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và phần mềm ABIS trực tuyến (http://www.tgw1916.net/bacteria_logare.html).
Hình 2.3. Cá Khoang cổ đỏ (trái) và thao tác tiêm vi khuẩn vào cá (phải) 2.4.4 Lập kháng sinh đồ
Phương pháp lập kháng sinh đồ được xác định theo phương pháp của Huys (2002). Vi khuẩn được phục hồi trên mơi trường NA (cĩ bổ sung 3% NaCl) ở 28OC trong 24 ± 2h; đồng thời được kiểm tra tính thuần bằng cách quan sát sự đồng nhất về hình thái khuẩn lạc và màu sắc trên mơi trường TCBS.
Các khuẩn lạc sau khi nuơi cấy và kiểm tra sẽ được pha thành dịch huyền phù với chỉ số McF là 0,5. Dùng tăm bơng vơ trùng nhúng vào dịch vi khuẩn, cấy trang đều lên bề mặt của đĩa thạch MHA (Himedia, Ấn Độ) với bề dày thạch theo tiêu chuẩn 20 ± 1mm, lặp lại thao tác từ 2 - 3 lần. Sau 15 phút, 8 khoanh giấy được tẩm trước với 8 loại kháng sinh lần lượt là Tetracycline (TE/30µg), Chloramphenicol (C/30µg), Amoxicilin (AMC/25µg), Cefadroxil (CD/30µg), Doxycyclin (D/30µg), Rifampicin (RA/5µg), Cefalexin (CL/30µg) và Cefixime (CFM/5µg) cùng khoanh giấy tẩm dung dịch 1% NaCl (đối chứng) được đặt lên mặt thạch đã được cấy dịch vi khuẩn sao cho phải tiếp xúc hồn tồn với mặt thạch và đem ủ ở 28O
C trong 24h ± 2h. Mỗi chủng vi khuẩn được lặp lại thí nghiệm 3 lần. Dịng vi khuẩn E. coli ATCC 25922 được sử dụng làm chủng tham chiếu.
Đường kính vịng vơ khuẩn bao gồm đường kính của khoanh giấy kháng sinh được đo bằng thước với đơn vị là mm. Dựa vào chuẩn đường kính vịng vơ khuẩn theo tiêu chuẩn của The Clinical and Laboratory Standards Institute (2007)
(CLSI - Tiêu chuẩn cơ sở lâm sàng và phịng thí nghiệm) để xác định dịng vi khuẩn mục tiêu kháng, nhạy hay trung gian với kháng sinh thử nghiệm (Phụ lục 2).
2.4.5 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thực vật 2.4.5.1 Chiết xuất dịch chiết thơ từ thực vật 2.4.5.1 Chiết xuất dịch chiết thơ từ thực vật
Đối với các loại thực vật: trầu khơng, trà xanh, ổi, trứng cá, cộng sản (cỏ lào), bạc hà, lơ hội, húng quế và diếp cá sử dụng bộ phận lá nên sẽ chọn những lá bánh tẻ, tươi, khơng cĩ dấu hiệu bệnh. Sau đĩ rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phịng, xay thật nhuyễn bằng máy xay, vắt lấy dịch ép và ly tâm ở 7.000 vịng trong 5 phút. Dịch nổi thu được được bảo quản nơi thống mát ở nhiệt độ phịng trước khi tiến hành thí nghiệm khơng quá 60 phút.
Đối với tỏi, nghệ vàng, nghệ xanh và nghệ đen sử dụng bộ phận củ nên sẽ chọn những củ chắc và đều. Bỏ vỏ, rửa sạch để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phịng. Tương tự với cách xử lý các loại lá trên, củ cũng được đem xay nhuyễn, vắt lấy dịch ép và ly tâm để thu dịch ép thơ.
2.4.5.2 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
Tiến hành thử nghiệm dịch chiết thực vật trên vi khuẩn phân lập được theo phương pháp thạch lỗ của Bộ mơn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nơi, 1998. Dùng tăm bơng vơ trùng nhúng vào dịch huyền phù vi khuẩn đã chuẩn bị trước với chỉ số McF 0,5 cấy trang đều trên bề mặt thạch MHA (với bề dày thạch 20 ± 1mm) đã được đục 5 lỗ với đường kính 5mm/lỗ trước đĩ, để khơ tự nhiên. Sau khoảng 2 phút, nhỏ vào mỗi lỗ tương ứng với tên thực vật đã đánh dấu khoảng 40µl dịch chiết thơ thực vật. Với lỗ trung tâm nhỏ vào nước muối sinh lý vơ trùng để làm đối chứng. Đem ủ trong tủ ấm ở 37O
C với chủng E.coli ATCC 25922 và 28OC với các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm cá cảnh biển tại Vinpearl, đồng thời với 2 chủng Vibrio TNX-X1 và YR-X2 gây bệnh trên cá ngựa (được phân lập xác định độc tính tại phịng thí nghiệm CNSH – Viện CNSH&MT). Xác định đường kính vịng trịn kháng khuẩn sau 24 ± 2h. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên các mẫu thực vật tại 3 thời điểm (ngày) khác nhau.
3 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ
3.1.1 Kiểm định chỉ tiêu nấm và ký sinh trùng
Cùng những quan sát về trạng thái cũng như các biểu hiện bên ngồi và thơng qua các thí nghiệm kiểm tra thì mẫu cá bệnh thu được hồn tồn khơng bị nhiễm tác nhân ký sinh trùng và nấm.
3.1.2 Phân lập vi khuẩn và định danh sơ bộ
Từ vết thương trên da, mẫu bệnh phẩm trong gan và thận của 20 cá bệnh đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn. Sau 24 ± 2h ủ ở nhiệt độ 28OC quan sát thấy hình thái các khuẩn lạc thu được đều cĩ kích thước nhỏ khoảng từ 1 - 2mm, màu trắng đục hoặc trắng, bề mặt trơn láng trên mơi trường NA (cĩ bổ sung 3% NaCl).
Thơng qua hình thái khuẩn lạc trên mơi trường TCBS, các phân tích về đặc điểm sinh lý và sinh hĩa, 30 chủng vi khuẩn phân lập được chia thành 4 nhĩm chính và đều cĩ một số đặc điểm chung như: vi khuẩn kỵ khí tùy ý, oxidase dương tính, cĩ khả năng sử dụng đường glucose, khơng sinh H2S và khơng sinh hơi trên mơi trường KIA, hồn tồn khơng sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4O
C) (Phụ lục 3).
Nhĩm 1 (5 chủng): nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc trong, đường kính 1 – 1,5mm; hầu hết đều khơng sinh trưởng và phát triển được ở nhiệt độ 42OC và trong mơi trường cĩ nồng độ muối cao.
Nhĩm 2 (5 chủng): nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc màu xanh, trịn bĩng, đường kính 2 – 2,5mm; cĩ khả năng sinh trưởng và phát triển ở mức nhiệt độ và nồng độ muối khác nhau.
Nhĩm 3 (9 chủng): nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc màu vàng, trịn bĩng, đường kính 2 – 2,5mm; tất cả đều phát triển được ở nhiệt độ 42OC nhưng khả năng chịu muối lại khơng giống nhau.
Nhĩm 4 (11 chủng): nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc màu vàng, hơi nhăn, tâm cĩ dạng vịng, đường kính 1.5 – 2mm; hầu hết đều khơng sinh trưởng và phát triển được ở nhiệt độ 42OC và trong mơi trường cĩ nồng độ muối cao.
Theo khĩa phân loại của Bergy (Breed và cs., 1957), các nhĩm vi khuẩn trên cĩ khả năng là Vibrio spp. hoặc Aeromonas spp. (dương tính với oxidase và cĩ khả năng sử dụng đường glucose) (Phụ lục 4).
3.1.3 Xác định độc lực của vi khuẩn và định danh vi khuẩn mục tiêu 3.1.3.1 Thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn 3.1.3.1 Thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn
Tiến hành cảm nhiễm ngẫu nhiên 6 chủng vi khuẩn thu từ 4 nhĩm: D1-2 (nhĩm 1) và D1-6 (nhĩm 2); nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc vàng trên mơi trường TCBS (nhĩm 3 và 4) cĩ tần suất xuất hiện trên cá bệnh cao hơn, do đĩ sẽ chọn hai chủng vi khuẩn trong mỗi nhĩm là D2-10 và D3-1 (nhĩm 3), D1-8 và D2-2 (nhĩm 4).
Kết quả gây cảm nhiễm trên cá Khoang cổ đỏ (Amphiprion frenatus) khỏe với các nghiệm thức tiêm vi khuẩn cho thấy chỉ cĩ chủng vi khuẩn D1-8 (nhĩm 4) (Hình 3.1) cĩ khả năng gây chết cá với biểu hiện hoạt động lờ đờ, bỏ ăn và chết sau thời gian cảm nhiễm ngắn nhưng khơng xuất hiện các tổn thương trên da và vây.
Ngồi ra, các chỉ tiêu mơi trường như: nhiệt độ, pH, NO2- và NH3/NH4+ vẫn ở mức cho phép trong suốt quá trình cảm nhiễm.
Kết quả cảm nhiễm được trình bày trong Bảng 3.1. Các chủng cịn lại lần lượt là D1-2, D1-6, D2-10, D3-1 và D2-2 được xác định khơng phải tác nhân gây bệnh (ở nồng độ tiêm 1,25x107 CFU/cá, cá vẫn khỏe mạnh sau 10 ngày theo dõi).
Bảng 3.1. Kết quả cảm nhiễm chủng D1-8 trên cá Khoang cổ đỏ (A. frenatus) Nồng độ Nồng độ tiêm (CFU/ml) Nồng độ tiêm (CFU/cá thể) Lần 1 (% cá chết) Lần 2 (% cá chết) Trung bình (% cá chết) 2.5x108 1,25 x107 85% 85% 85% 1.25 x108 6,25 x106 60% 55% 57,5% 6.25 x107 3,13 x106 30% 20% 25%