2.4.5.1 Chiết xuất dịch chiết thơ từ thực vật
Đối với các loại thực vật: trầu khơng, trà xanh, ổi, trứng cá, cộng sản (cỏ lào), bạc hà, lơ hội, húng quế và diếp cá sử dụng bộ phận lá nên sẽ chọn những lá bánh tẻ, tươi, khơng cĩ dấu hiệu bệnh. Sau đĩ rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phịng, xay thật nhuyễn bằng máy xay, vắt lấy dịch ép và ly tâm ở 7.000 vịng trong 5 phút. Dịch nổi thu được được bảo quản nơi thống mát ở nhiệt độ phịng trước khi tiến hành thí nghiệm khơng quá 60 phút.
Đối với tỏi, nghệ vàng, nghệ xanh và nghệ đen sử dụng bộ phận củ nên sẽ chọn những củ chắc và đều. Bỏ vỏ, rửa sạch để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phịng. Tương tự với cách xử lý các loại lá trên, củ cũng được đem xay nhuyễn, vắt lấy dịch ép và ly tâm để thu dịch ép thơ.
2.4.5.2 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
Tiến hành thử nghiệm dịch chiết thực vật trên vi khuẩn phân lập được theo phương pháp thạch lỗ của Bộ mơn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nơi, 1998. Dùng tăm bơng vơ trùng nhúng vào dịch huyền phù vi khuẩn đã chuẩn bị trước với chỉ số McF 0,5 cấy trang đều trên bề mặt thạch MHA (với bề dày thạch 20 ± 1mm) đã được đục 5 lỗ với đường kính 5mm/lỗ trước đĩ, để khơ tự nhiên. Sau khoảng 2 phút, nhỏ vào mỗi lỗ tương ứng với tên thực vật đã đánh dấu khoảng 40µl dịch chiết thơ thực vật. Với lỗ trung tâm nhỏ vào nước muối sinh lý vơ trùng để làm đối chứng. Đem ủ trong tủ ấm ở 37O
C với chủng E.coli ATCC 25922 và 28OC với các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm cá cảnh biển tại Vinpearl, đồng thời với 2 chủng Vibrio TNX-X1 và YR-X2 gây bệnh trên cá ngựa (được phân lập xác định độc tính tại phịng thí nghiệm CNSH – Viện CNSH&MT). Xác định đường kính vịng trịn kháng khuẩn sau 24 ± 2h. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên các mẫu thực vật tại 3 thời điểm (ngày) khác nhau.
3 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ
3.1.1 Kiểm định chỉ tiêu nấm và ký sinh trùng
Cùng những quan sát về trạng thái cũng như các biểu hiện bên ngồi và thơng qua các thí nghiệm kiểm tra thì mẫu cá bệnh thu được hồn tồn khơng bị nhiễm tác nhân ký sinh trùng và nấm.
3.1.2 Phân lập vi khuẩn và định danh sơ bộ
Từ vết thương trên da, mẫu bệnh phẩm trong gan và thận của 20 cá bệnh đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn. Sau 24 ± 2h ủ ở nhiệt độ 28OC quan sát thấy hình thái các khuẩn lạc thu được đều cĩ kích thước nhỏ khoảng từ 1 - 2mm, màu trắng đục hoặc trắng, bề mặt trơn láng trên mơi trường NA (cĩ bổ sung 3% NaCl).
Thơng qua hình thái khuẩn lạc trên mơi trường TCBS, các phân tích về đặc điểm sinh lý và sinh hĩa, 30 chủng vi khuẩn phân lập được chia thành 4 nhĩm chính và đều cĩ một số đặc điểm chung như: vi khuẩn kỵ khí tùy ý, oxidase dương tính, cĩ khả năng sử dụng đường glucose, khơng sinh H2S và khơng sinh hơi trên mơi trường KIA, hồn tồn khơng sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4O
C) (Phụ lục 3).
Nhĩm 1 (5 chủng): nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc trong, đường kính 1 – 1,5mm; hầu hết đều khơng sinh trưởng và phát triển được ở nhiệt độ 42OC và trong mơi trường cĩ nồng độ muối cao.
Nhĩm 2 (5 chủng): nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc màu xanh, trịn bĩng, đường kính 2 – 2,5mm; cĩ khả năng sinh trưởng và phát triển ở mức nhiệt độ và nồng độ muối khác nhau.
Nhĩm 3 (9 chủng): nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc màu vàng, trịn bĩng, đường kính 2 – 2,5mm; tất cả đều phát triển được ở nhiệt độ 42OC nhưng khả năng chịu muối lại khơng giống nhau.
Nhĩm 4 (11 chủng): nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc màu vàng, hơi nhăn, tâm cĩ dạng vịng, đường kính 1.5 – 2mm; hầu hết đều khơng sinh trưởng và phát triển được ở nhiệt độ 42OC và trong mơi trường cĩ nồng độ muối cao.
Theo khĩa phân loại của Bergy (Breed và cs., 1957), các nhĩm vi khuẩn trên cĩ khả năng là Vibrio spp. hoặc Aeromonas spp. (dương tính với oxidase và cĩ khả năng sử dụng đường glucose) (Phụ lục 4).
3.1.3 Xác định độc lực của vi khuẩn và định danh vi khuẩn mục tiêu 3.1.3.1 Thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn 3.1.3.1 Thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn
Tiến hành cảm nhiễm ngẫu nhiên 6 chủng vi khuẩn thu từ 4 nhĩm: D1-2 (nhĩm 1) và D1-6 (nhĩm 2); nhĩm vi khuẩn cĩ hình thái khuẩn lạc vàng trên mơi trường TCBS (nhĩm 3 và 4) cĩ tần suất xuất hiện trên cá bệnh cao hơn, do đĩ sẽ chọn hai chủng vi khuẩn trong mỗi nhĩm là D2-10 và D3-1 (nhĩm 3), D1-8 và D2-2 (nhĩm 4).
Kết quả gây cảm nhiễm trên cá Khoang cổ đỏ (Amphiprion frenatus) khỏe với các nghiệm thức tiêm vi khuẩn cho thấy chỉ cĩ chủng vi khuẩn D1-8 (nhĩm 4) (Hình 3.1) cĩ khả năng gây chết cá với biểu hiện hoạt động lờ đờ, bỏ ăn và chết sau thời gian cảm nhiễm ngắn nhưng khơng xuất hiện các tổn thương trên da và vây.
Ngồi ra, các chỉ tiêu mơi trường như: nhiệt độ, pH, NO2- và NH3/NH4+ vẫn ở mức cho phép trong suốt quá trình cảm nhiễm.
Kết quả cảm nhiễm được trình bày trong Bảng 3.1. Các chủng cịn lại lần lượt là D1-2, D1-6, D2-10, D3-1 và D2-2 được xác định khơng phải tác nhân gây