M Ở ĐẦU
3.4.4. Giám định kháng nguyên H, O
S. choleraesuis có công thức kháng nguyên S. 67: c-1,5 [4]. Kết quả giám định kháng nguyên cho thấy S. choleraesuis 539 tạo phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh nguyên O67, và H1,5 trùng hợp S.choleraesuis. Như vậy đột biến gen crp đã không làm thay đổi sự biểu hiện hai kháng nguyên này của S.choleraesuis.
3.4.5. So sánh trình tự gen của S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δcrp
Để khẳng định chắc chắn hơn kết quả gây đột biến gen crp, đoạn gen Δcrp
được khuếch đại bằng cặp mồi Pr5F-Pr6R, sau đó tinh sạch sản phẩm thu được và gửi giải trình tự tại công ty Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự thu được được tiến hành xử lý, so sánh với trình tự gen crp (SC-B67) của S. choleraesuis trên ngân hàng Genbank, từ đó chúng tôi xác định được gen Δcrp bị mất đi một đoạn 322bp, từ nucleotide 545 đến nucleotide 867, so với gen crp ban đầu.
Khi so sánh kết quả giải trình tự gen của S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δcrp, ta thấy đoạn gen crpở chủng đột biến bị mất 1 đoạn khoảng 322 nucleotide từ nucleotide thứ 545 đến nucleotide thứ 867. Như vậy, đoạn gen crp đã được gây đột biến thành công trên bộ gen của S. choleraesuis.
S. choleraesuis Smith 541 AATGGTTCTTGTCTCATTGCCACATTCATAAGTACCCGTCAAAGAGCACGCTGATTCACC 600 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570121 AATGGTTCTTGTCTCATTGCCACATTCATAAGTACCCGTCAAAGAGCACGCTGATTCACC 3570180
S. choleraesuis Smith 601 AGGGTGAAAAAGCAGAAACGCTGTACTACATCGTTAAAGGCTCCGTGGCAGTGCTGATCA 660 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570181 AGGGTGAAAAAGCAGAAACGCTGTACTACATCGTTAAAGGCTCCGTGGCAGTGCTGATCA 3570240
S. choleraesuis Smith 661 AAGATGAAGAAGGGAAAGAAATGATCCTTTCTTATCTGAATCAAGGTGATTTTATTGGTG 720 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570241 AAGATGAAGAAGGGAAAGAAATGATCCTTTCTTATCTGAATCAAGGTGATTTTATTGGTG 3570300
S. choleraesuis Smith 721 AACTGGGCCTGTTTGAAGAAGGCCAGGAACGCAGCGCCTGGGTACGTGCGAAAACCGCAT 780 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570301 AACTGGGCCTGTTTGAAGAAGGCCAGGAACGCAGCGCCTGGGTACGTGCGAAAACCGCAT 3570360
S. choleraesuis Smith 781 GTGAGGTCGCTGAAATTTCCTACAAAAAATTTCGCCAATTAATCCAGGTCAACCCGGATA 840 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570361 GTGAGGTCGCTGAAATTTCCTACAAAAAATTTCGCCAATTAATCCAGGTCAACCCGGATA 3570420
S. choleraesuis Smith 841 TTCTGATGCGCCTCTCTTCCCAGATGGCTCGTCGCTTACAAGTCACCTCTGAAAAAGTAG 900 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570421 TTCTGATGCGCCTCTCTTCCCAGATGGCTCGTCGCTTACAAGTCACCTCTGAAAAAGTAG 3570480
S. choleraesuis Smith 901 GTAACCTCGCCTTCCTTGACGTCACCGGGCGTATCGCTCAGACGCTGCTGAATCTGGCGA 960 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
S. choleraesuis /Δcrp 3570481 GTAACCTCGCCTTCCTTGACGTCACCGGGCGTATCGCTCAGACGCTGCTGAATCTGGCGA 3570540
Hình 3.11 Trình tự đoạn gen khuếch đại từ cặp mồi Pr5F- Pr6R của gen Δcrp
với đoạn 322 bp (545-867) (bôi đen) bị mất so với gen crp của Salmonella choleraesuis nhược độc.
Kết luận và kiến nghị
Kết luận
Thông qua những kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đi đến những kết luận:
1. Đã tạo được dòng vector pBSIIK+/crp. 2. Đã tạo được dòng plasmid pRE112/crp.
3. Đã tạo thành công chủng S. choleraesuis 539 mang gen crp đột biến.
4. Xác định được các đặc tính nuôi cấy, sinh hóa của chủng S. choleraesuis 539 mang gen crp đột biến.
Kiến nghị
1. Tiếp tục gây đột biến gen asd trên chủng S. choleraesuis 539 để tạo chủng
S.choleraesuis mang hai gen crp và asd đột biến.
2. Từ chủng nói trên nghiên cứu quy trình sản xuất vắc-xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Cheryl L. Patten, Công nghệ sinh học phân tử - Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp, Nxb KHKT.
2. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng (1986), Bệnh gia súc non tập II, NXB
NN, Hà Nội.
3. Hoàng Trọng Phán, giáo trình “Di truyền học”, Đại học Huế.
4. Nguyễn Như Thanh (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh
vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở, Trần Thị Thu Hà (1989), Kết quả điều tra về tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn, tuyển tập Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y 1985-1989, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 1989.
7. PGS.TS. Nguyễn Như Thanh, (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
8. Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn vùng Tây Nguyên và khả năng phòng trị, Luận án PTS KH Nông Nghiệp, Hà Nội. 9. Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú (1999), Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và
Salmonella ở lơn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập được, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập 6– Hội thú y Việt Nam, Hà Nội
TIẾNG ANH
10.Chen Z.W., Hsuan S.L., Liao J.W., Chen T.H., Wu C.M., Lee W.C., Lin C.C., Liao C.M., Yeh K.S., Winton J.R., Huang C, Chien M.S., (2010), Mutations in the Salmonella enterica serovar Choleraesuis cAMP-receptor protein gene lead to functional defects in the SPI-1 Type III secretion system, Vet Res, (41), 1-5.
11.Chu C.Y., Wang S.Y., Chen Z.W., Chien M.S., Huang J.P., Chen J.J., et al., (2007), Heterologous protection in pigs induced by a plasmid-cured and crp
gene-deleted S.choleraesuis live vaccine, Vaccine, (25), 7031–7040.
12.Chuan Y.U. et al., (2010), Construction and Characterization of a
S.choleraesuis C78-1 crp Deletion Mutant, Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 41 (5).
13.Dean A..G., Ching Y.C., Williams and Harden L.B. (1972), “Test for E.coli Enterotoxin using infant mice”, J. Infect, Dis, 125(4): 407-11.
14.Gao H., Zhang Y., Yang L., Liu X., Guo Z., Tan Y., Han Y., Huang X., Zhou D., Yang R.,.(2011), Regulatory effects of cAMP receptor protein (CRP) on porin genes and its own gene in Yersinia pestis, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, PR China.
15.Hackett J., (1990), Salmonella-based vaccines, Vaccine, 8(1): 5-11.
16.Kang H.Y., Dozois C.M., Tinge S.A., Lee T.H., Curtiss R., (2002), Trasduction-mediated transfer of unmarked delection and point mutations through use of counterselectable suicide vector, 184(1): 307-12..
17.Kennedy M.J., Yancey R.J. Jr, Sanchez M.S., Rzepkowski R.A., Kelly S.M., Curtiss R. III, (1999), Attenuation and immunogenicity of cya crp
18.Moos M.., (1995), Models of risk assessments for biologicals or related products in the European Union, Revue Scientifique et
19.Morris I.A, Way C., Sojka W.J. (1976), “The effect of T and B lymphocyte depletion on the protection of mice vaccinated with a gel Emutant of Salmone.la typhimurium”, Bristh J. of Exp.
20.Salmon, D. E. And Smith. 1885. Report on swine plague. U.S. Bureau of Animal Industies, 2nd Annual Report, U.S. Government Printing Office, Washington, DC.
21.Sandefur P.D., Peterson J.W. (1977), Neutralization of Salmonella Toxin- induced elongation of chinese- hamster-ovary cell choleranti Toxin, Ibid,Vol 1.
22.Schwartz K.J., Salmonellosis, Straw B.E., D’Allaire S., Mengeling W., Taylor D.J. (Eds.), (1999), Disease of swine, Iowa State University Press, Ames.
23.Sedlock D.M., Deibel R.H. (1978), Dectection of Salmonella typhimurium
EnteroToxin using rabbit iieal loops, Can.J.Microbiol.
24.Sedlock D.M., Koupal B.N., Deibel R.H. (1978), Production and partial
purification of Salmonella eteroToxin, J.Immun, Vol 20.
25.Simone Oliveria, University of Minnesota, November 9, 2010, Development and validation of molecular-based tools to differentiate attenuated
Salmonella choleraesuis vaccine strains from field isolates - NPB #: 09-094. 26.Busby S., Ebright R.H.,(1999), Transcription Activation by Catabolite
Activator Protein (CAP), 293(2): 199-213.
27.Taylor, Wilkins (1961), The effects of Salmonella and Shigella on the ligated loops of rabbits gut, India J.Med.Res.
28.Terpstra, C., Kroese, A.H., (1996), Potency control of modified live viral vaccines for veterinary use, Vaccine, 14(1), 13-18.
29.Wegener, M., Bruckner, L., Cubetaler, K., (1998), The establishment of endotoxin limits which satisfy animal welfare considerations in the testing of provine vaccine, ALTEX: Alternativen zu Tierexperimenten.
30.Xu Y.D. et al., (2006), Construction and characterization of delta crp delta asd mutant host-vector balanced lethal system of S.choleraesuis C500 strain, 22(3): 366-72.
TÀI LIỆU ONLINE
31.http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/S.arizonae.BA.jpg
32.http://www.spiegel.de/wissenschaft/mensch/0,1518,295445,00.html
33.http://www.thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/di-truyen-phan-tu/602-