M Ở ĐẦU
3.3.2. Sàng lọc dòng tế bào S.choleraesuis mang gen crp đột biến
Những khuẩn lạc S. choleraesuis mọc trên môi trường LB + Cm được chọn ngẫu nhiên để cấy tinh sạch một lần trên môi trường chọn lọc (LB+Cm). Từng khuẩn lạc riêng rẽ thu được sau quá trình tinh sạch được cấy vào môi trường lỏng LB không muối, không kháng sinh (NB) để quá trình trao đổi chéo diễn ra giữa gen
crp đột biến trong plasmid và gen crp nguyên vẹn trong genome của S. cholerasuis. Dịch nuôi cấy sau 6h, được pha loãng đến 10-5 và cấy đồng thời lên 2 loại môi trường: môi trường LB không muối, không kháng sinh (NA) và môi trường NA có chứa 5% đường sucrose để chọn lọc những dòng S. choleraesuis kháng sucrose, tức là những dòng đã diễn ra quá trình trao đổi chéo làm mất đi gen SacB1, một gen
tổng hợp enzyme luvansucrase thuỷ phân đường sucrose tạo sản phẩm luvan là chất gây ức chế sự sinh trưởng hoặc có khả năng gây chết đối với tế bào Salmonella.
Những dòng kháng sucrose này được tiếp tục cấy đồng thời lên 2 loại môi
trường: môi trường LB và môi trường LB có chứa Cm để loại bỏ những dòng kháng
sucrose do gen SacB1 bị đột biến.
Cuối cùng tiến hành kiểm tra các dòng chọn lọc được bằng phản ứng PCR với 2 cặp mồi Pr5F-Pr6R, và Pr6F-Pr7R.
Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis
539/Δcrp (1), S. choleraesuis Smith (2), plasmid của χ7213/pRE112/Δcrp (3) với
cặp mồi Pr5F-Pr6R (ảnh trái), và Pr6R-Pr7F (ảnh phải) trên gel agarose 1,2%.
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi Pr5F-Pr6R cho thấy đoạn gen
Δcrp được khuếch đại có kích thước khoảng 600 bp, tương ứng với đoạn gen Δcrp
trong plasmid χ7213/pRE112/Δcrp. Điều này chứng tỏ đoạn gen crp đã được gây đột biến ở dòng S.choleraesuis 539.
Theo hình 3.13, hình phải cho thấy gen crp của dòng S.choleraesuis 539 (kích thước 1400 bp) bị mất đi một đoạn gen khoảng 300 bp so với chủng S. choleraesuis
Smith (có kích thước 1700bp). Điều này chứng tỏ đã gây đột biến thành công gen
crpở dòng S.choleraesuis 539. M 1 2 3 1500bp 500bp M 1 2 1500b p