2.2.2.1. Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được phân tích theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002).
a. Cách tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch chất chống oxy hóa với các nồng
độtương ứng là 0,5N, 1N, 1,5N, 2N, 2,5N, 1ml methanol và 1ml dung dịch DPPH 0,1mM. Trộn đều hỗn hợp rồi để phản ứng xảy ra trong bóng tối ở
nhiệt độ thường. Sau 30 phút phản ứng, đem hỗn hợp đo độ hấp thụở bước sóng 517nm trên quang phổ kế UV/VIS. Mẫu đối chứng được tiến hành
tương tự nhưng thay 2ml chất chống oxy hóa bằng dung môi. PA được hòa
tan trong nước nên 2ml dung môi là nước cất. b. Tính kết quả:
Khả năng khử gốc tự do DPPH được tính dựa vào phương trình đường chuẩn DPPH.
Hình 2.3. Đường chuẩn DPPH
2.2.2.2. Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic bằng phương pháp Ferric Thiocyanate (FTC)
Phương pháp FTC được Haraguchi và cộng sự xây dựng vào năm 1992.
a. Cách tiến hành:
Hỗn hợp thí nghiệm gồm có: 0,1 mL dung dịch acid phytic có các nồng
độ tương ứng là 0,5N, 1N, 1,5N, 2N, 2,5N, 65 µl EPA pha trong Tween, 5 mL đệm phosphat 0,04 M; 5 mL EtOH 75%, 2 mL nước cất và giữ ở 45°C, trong bóng tối. Hỗn hợp này cũng được chuẩn bị thêm phản ứng không có
chất chống oxy hóa để làm đối chứng. Sau mỗi 24h lấy ra 1 mL mẫu, thêm 5 mL EtOH 75%, 0,5 mL NH4SCN 30%, 0,5 mL FeCl2 0,02M trong HCl
3,5% tương ứng. Sau khi mẫu có màu đỏ, độ hấp thu được đo ngay lập tức ở bước sóng 500nm. Sử dụng ethanol để hiệu chỉnh máy quang phổ về vạch 0.
b. Tính kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ của mẫu trắng đo ở bước sóng 500nm
A: Độ hấp thụ của mẫu được bổ sung chất chống oxy hóa đo ở bước sóng 500nm
2.2.2.3. Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic dựa vào khả năng khử hydroperoxide
Khả năng khử hydroperoxide của acid phytic được phân tích theo phương pháp của Nabavi và cộng sự (2009).
a. Cách tiến hành:
Cho vào 5 ống nghiệm mỗi ống 0,5ml dung dịch acid phytic có các nồng độ tương ứng là 0,5N, 1N, 1,5N, 2N, 2,5N. Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 2,5ml H2O2 trong đệm phosphate pH = 7,4 và 1ml dung dịch đệm phosphate pH = 7,4. Lắc đều rồi để ở nhiệt độ phòng 10 phút sau đó đem đi đo độ hấp thụ ởbước sóng 230nm trên máy UV-Vis.
Sau mỗi lần đo các mẫu được auto zero lại bằng mẫu được pha: 1ml
mẫu + 3ml đệm.
Mẫu đối chứng được pha bằng cách cho: 0,5ml nước cất+ 1ml đệm +
2,5ml H2O2.
Mẫu auto zero mẫu đối chứng được pha bằng cách cho 1ml nước cất + 3 ml đệm.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
b. Tính kết quả:
Kết quả được tính dựa vào công thức sau: [H2O2] bị khử (%) =[(A0-A)/A0]*100
Trong đó: A0: Giá trị hấp thụ của mẫu đối chứng ởbước sóng 230nm. A: Giá trị hấp thụ của mẫu acid phytic ở bước sóng 230nm
2.2.3.4. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2
Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic bằng mô hình phản
ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 được tiến hành theo phương pháp
của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2013). a. Cách tiến hành:
Cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 40µl myoglobin 100µM và 40µl H2O2 100µM. Lắc đều để phản ứng xảy ra trong 5 phút ở nhiệt độ
phòng, sau đó cho tiếp vào ống nghiệm 80µl EPA trong Tween, 40µl chất chống oxy hóa. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC
trong 30 phút. Sau đó, cho thêm vào 0,3ml KCl 1,15%, 4,5ml H3PO4 1%, 1ml TBA 0,6%. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 95oC trong
45 phút. Sau đó, làm nguội nhanh dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng để
yên trong 10 phút. Dùng pipet hút lớp dung dịch bên dưới đem đi đo độ hấp thụ ởbước sóng 535nm trên quang phổ kế UV-VIS.
Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự nhưng thay 0,2ml chất chống oxy hóa bằng 0,2ml dung môi dùng để hòa tan chất chống oxy hóa.
b. Cách tính kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100
Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 535nm
A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bước sóng 535nm
2.2.3.5. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của phytic bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2
Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic bằng mô hình phản
ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 được tiến hành theo phương pháp của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2013).
a. Cách tiến hành
Cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 40µl FeCl2 100µM và 40µl H2O2 100µM. Lắc đều để phản ứng xảy ra trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau
đó cho tiếp vào ống nghiệm 80µl EPA pha trong Tween, 40µl chất chống oxy
hóa. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủở nhiệt độ 37oC trong 30 phút.
Sau đó, cho thêm vào 0,3ml KCl 1,15%, 4,5ml H3PO4 1%, 1ml TBA 0,6%.
Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 95oC trong 45 phút. Sau
đó, làm nguội nhanh dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng để yên trong 10 phút. Dùng pipet hút lớp dung dịch bên dưới đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 535nm trên quang phổ kế UV-VIS.
Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự nhưng thay 0,2ml chất chống oxy hóa bằng 0,2ml nước cất.
b. Cách tính kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100
Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ởbước sóng 535nm
A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bước sóng 535nm