Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng vitamin B1, chúng tôi đã lựa chọn phương HPLC với detector huỳnh quang để phát hiện và định lượng vitamin B1 trong gạo. Đây là phương pháp có hiệu quả phân tích, độ
chính xác cao cũng như có thể tự động hoá trong trường hợp phân tích hàng loạt mẫu.
Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây:
2.3.2.1. Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC [8], [6], [7], [10]
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau
2.3.2.2. Cấu tạo của hệ thống HPLC
Hình 2.3.3: Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa dung môi pha động
2: Bơm cao áp đẩy pha động qua hệ thống sắc ký 3: Van bơm mẫu
4: Cột sắc ký
5: Bộ phận phát hiện Detector 6: Bình chứa dung môi thải
2.3.2.3. Phân tích định tính và phân tích định lượng bằng HPLC [8]
Phân tích định tính
Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích có thời gian lưu khác nhau và cố định. Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu.
Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào.
Phân tích định lượng
Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất tỷ lệ với diện tích hay chiều cao pic.
Hi = k1×Ci
Si = k2×Ci
Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian lưu tRi
k1, k2 là các hằng số thực nghiệm
Trong HPLC có nhiều phương pháp định lượng. Việc chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích.
Phương pháp đường chuẩn:
Chuẩn bị dãy dung dịch các chất chuẩn với nồng độ tăng dần tiến hành chạy sắc ký. Vẽ đồ thị liên quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ mỗi chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính nồng độ các chất cần xác định. Thực hiện việc tính toán này theo hai cách: áp diện tích hoặc chiều cao pic vào đường chuẩn để suy ra nồng độ của chất trong mẫu.
Đồ thị 2.3.1: Đồ thị tương quan giữa diện tích pic với nồng độ.
Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính Y = a + b.Cx
Trong đó: Y: Diện tích hay chiều cao pic
a : Giao điểm của đường chuẩn với trục tung b : Độ dốc của đường chuẩn
Cx: Nồng độ của chất phân tích
Dựa vào phương trình đường chuẩn để tính nồng độ chất phân tích. Chú ý độ lớn diện tích hay chiều cao pic của chất phân tích phải nằm trong đường chuẩn. Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm. Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với
C nồng độ
S
diện tích
mẫu phân tích về thành phần nền, thành phần hoá học và vật lý dễ mắc sai số lớn. Trong trường hợp này để loại trừ ảnh hưởng của nền, người ta dựng phương pháp thêm chuẩn.
2.3.2.4. Quy trình dự kiến tách và xác định vitamin B1 trong gạo [16], [19],
[25]
* Nguyên tắc
Vitamin B1 được tạo dẫn xuất với K3Fe(CN)6 trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm phát huỳnh quang thiochrom. Dẫn xuất được phân tích trên thiết bị HPLC, detector RF có bước sóng kích hoạt 366nm và bước sóng phát xạ 435nm.
Cân 10÷15g mẫu gạo đã đồng nhất/ bình nỉn 250ml + 60÷65ml HCl 0,1N Thuỷ phân 1000C/30phút Để nguội, chỉnh pH=4,5 bằng CH3COONa 2,5M + Enzyme Ủ ở 37oC trong 18 giờ Lọc hút chõn khụng Định mức 100ml bằng H20 Lọc qua giấy lọc Thu dịch lọc
Lấy 200 µl đem dẫn xuất
HPLC