Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và thuốc thử

 Thiết bị và dụng cụ

 Hệ thống HPLC của hãng Shimazu với detectơ huỳnh quang

 Cột phân tích water C18 (250mm×4,6mm, cỡ hạt 5µm) hóng Symmestry

 Máy lọc hút chân không

 Máy siâu âm

 Cân phân tích độ chính xác 0,0001g

 Tủ ấm của hãng Shellab

 Máy chỉnh pH

 Bình định mức 10ml, 25ml, 50ml, 100ml

 Bình nón 250ml

 Các loại pipet thủy tinh có dung tích 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 50ml

 Pipet paster

 Pipet man dung tích 200µl, 1000µl

 Hóa chất và thuốc thử

Thuốc thử và hóa chất phải tinh khiết dùng cho máy sắc HPLC. Sử dụng nước cất 2 lần.

 Chuẩn vitamin B1 tinh khiết ( 99,6% ) của Viện Kiểm nghiệm thuốc quốc gia.

 Dung dịch acid acetic 2,5%: hút 12,5ml acid acetic 100% của Merck cho vào bình định mức 500ml và định mức tới vạch bằng nước cất

 Pha chuẩn:

 Dung dịch chuẩn vitamin B1 100ppm:Cân 0,01g chuẩn vitamin B1 tinh khiết chính xác đến 0,00001g hồ tan hoàn toàn trong acid acetic 2,5%, cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng acid acetic 2,5%.

 Dung dịch chuẩn trung gian 25 ppm: Hút chính xác 5ml dung dịch chuẩn 100 ppm, cho vào bình định mức 20ml, định mức đến vạch bằng acid acetic 2,5%.

 Dãy dung dịch chuẩn làm việc: Từ dung dịch chuẩn trung gian vitamin B1 25 ppm, ta tiến hành pha loãng bằng acid acetic 2,5%, được các dãy các dung dịch chuẩn làm việc cú nồng độ từ 0,05; 0,2; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 8,0; 10,0 ppm.

 Dung dịch Natri acetat (CH3COONa) 2,5M: Cân chính xác 20,8g Natri acetat của Merck hòa tan bằng nước, cho vào bình định mức 1000ml,định mức đến vạch bằng nước. Nếu pha bằng Natri acetate trihydrate (CH3COONa.3H2O) thì cân 170,1g hồ tan bằng nước cất cho vào bình định mức 1000ml, định mức tới vạch bằng nước cất.

 Dung dịch Natri hydroxit (NaOH) 3,75M: Cân chính xác 15g NaOH của Merck dựng nước định mức đến 100ml.

 Chuẩn bị pha động chạy sắc ký:

 Đệm Acetat (0,05M, pH=4,5): Hút 2,85ml acid acetic (99%-100%) của Merck cho vào bình định mức 1000ml, định mức bằng nước cất. Đem chỉnh pH=4,5 bằng NaOH 3,75M.

 Methanol (MeOH) của Merck

 Dung dịch Kali ferricyanide (K3Fe(CN)6) 1%: Cân chính xác 1g K3Fe(CN)6 của Merck hồ tan bằng nước cất, cho vào bình định mức 100ml và định mức tới vạch bằng nước cất.

 Dung dịch dẫn xuất K3Fe(CN)6 : Hút chính xác 1ml K3Fe(CN)6 1%, cho vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch bằng dung dịch NaOH 3,75M. Dung dịch dẫn xuất được bảo quản ở nhiệt độ 4oC, tránh ánh sáng.

 Dung dịch axit HCl 0,1N: Hút 8,5ml dung dịch HCl đậm đặc (37%, d=1,19) của Merck cho vào bình định mức 1000ml, định mức đến vạch bằng nước cất.

 Enzyme Taka-diastase từ Aspergillus oryzae (hãng Sigma, hoạt độ ≈ 100u/mg), Clara- diastase (hãng Fluka, hoạt độ ≥35u/mg), α-Amylase

từ Aspergillus oyzae (hãng Sigma, hoạt độ ≈37,2u/mg). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Chuẩn bị dung dịch enzyme 5%; 10%; 15%: Cân 5; 10; 15g enzyme Taka-diastase, 5; 10; 15g Clara- diastase, 5; 10; 15g α-Amylase: cho lần lượt vào bình định mức 100ml, hồ tan bằng nước và định mức tới vạch bằng nước. Sử dụng trong ngày và bảo quản ở nhiệt độ 2-80C

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Khảo sát xây dựng phương pháp xác định vitamin B1 trong gạo 2.2.2. Đánh giỏ phương pháp đã xây dựng

- Xác định khoảng tuyến tính. Lập đường chuẩn - Xác định giới hạn phát hiện (LOD)

- Xác định giới hạn định lượng (LOQ) - Xác định độ lặp lại (SD)

- Xác định độ đúng của phương pháp thông qua hiệu suất thu hồi R%

2.2.3. Ứng dụng phương pháp xác định vitamin B1 trong một số loại gạo

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu

Mẫu nghiên cứu gồm 2 loại gạo: RN64, Nàng Xuân. Các mẫu này được lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại một số chợ, đại lý trên địa bàn nội thành Hà Nội như: Chợ Cầu Giấy, chợ Mơ, chợ Ngã Tư Sở, chợ Hoàng Mai...

Chọn mẫu, tiến hành lấy mẫu theo TCVN 5451-1991. [1]

Mỗi loại mẫu mua tại 3 cửa hàng, khối lượng mỗi mẫu mua từ 2kg- 5kg cho vào túi chất dẻo chứa mẫu, đóng kín, ghi tên mẫu và mang về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được trộn đều, xay mịn, đồng nhất và phân tích. Mỗi mẫu sau khi đã trộn, được phân tích lặp lại 3 lần và cú kèm một mẫu thờm chuẩn để xác định độ lặp lại và hiệu suất thu hồi trờn từng đối tượng mẫu. Phần mẫu lưu cho vào trong túi đựng mẫu và bảo quản trong tủ mẫu.

2.3.2. Phương pháp phân tích vitamin B1

Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng vitamin B1, chúng tôi đã lựa chọn phương HPLC với detector huỳnh quang để phát hiện và định lượng vitamin B1 trong gạo. Đây là phương pháp có hiệu quả phân tích, độ

chính xác cao cũng như có thể tự động hoá trong trường hợp phân tích hàng loạt mẫu.

Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây:

2.3.2.1. Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC [8], [6], [7], [10]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

2.3.2.2. Cấu tạo của hệ thống HPLC

Hình 2.3.3: Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC

Trong đó:

1: Bình chứa dung môi pha động

2: Bơm cao áp đẩy pha động qua hệ thống sắc ký 3: Van bơm mẫu

4: Cột sắc ký

5: Bộ phận phát hiện Detector 6: Bình chứa dung môi thải

2.3.2.3. Phân tích định tính và phân tích định lượng bằng HPLC [8]

 Phân tích định tính

Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích có thời gian lưu khác nhau và cố định. Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu.

Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào.

 Phân tích định lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất tỷ lệ với diện tích hay chiều cao pic.

Hi = k1×Ci

Si = k2×Ci

Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian lưu tRi

k1, k2 là các hằng số thực nghiệm

Trong HPLC có nhiều phương pháp định lượng. Việc chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích.

 Phương pháp đường chuẩn:

Chuẩn bị dãy dung dịch các chất chuẩn với nồng độ tăng dần tiến hành chạy sắc ký. Vẽ đồ thị liên quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ mỗi chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính nồng độ các chất cần xác định. Thực hiện việc tính toán này theo hai cách: áp diện tích hoặc chiều cao pic vào đường chuẩn để suy ra nồng độ của chất trong mẫu.

Đồ thị 2.3.1: Đồ thị tương quan giữa diện tích pic với nồng độ.

Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính Y = a + b.Cx

Trong đó: Y: Diện tích hay chiều cao pic

a : Giao điểm của đường chuẩn với trục tung b : Độ dốc của đường chuẩn

Cx: Nồng độ của chất phân tích

Dựa vào phương trình đường chuẩn để tính nồng độ chất phân tích. Chú ý độ lớn diện tích hay chiều cao pic của chất phân tích phải nằm trong đường chuẩn. Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm. Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với

C nồng độ

S

diện tích

mẫu phân tích về thành phần nền, thành phần hoá học và vật lý dễ mắc sai số lớn. Trong trường hợp này để loại trừ ảnh hưởng của nền, người ta dựng phương pháp thêm chuẩn.

2.3.2.4. Quy trình dự kiến tách và xác định vitamin B1 trong gạo [16], [19],

[25]

* Nguyên tắc

Vitamin B1 được tạo dẫn xuất với K3Fe(CN)6 trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm phát huỳnh quang thiochrom. Dẫn xuất được phân tích trên thiết bị HPLC, detector RF có bước sóng kích hoạt 366nm và bước sóng phát xạ 435nm.

Cân 10÷15g mẫu gạo đã đồng nhất/ bình nỉn 250ml + 60÷65ml HCl 0,1N Thuỷ phân 1000C/30phút Để nguội, chỉnh pH=4,5 bằng CH3COONa 2,5M + Enzyme Ủ ở 37oC trong 18 giờ Lọc hút chõn khụng Định mức 100ml bằng H20 Lọc qua giấy lọc Thu dịch lọc

Lấy 200 µl đem dẫn xuất

HPLC

2.3.3. Phương pháp xử lý kết quả

Trung bình mẫu:

Công thức tính độ lệch chuẩn (SD):

Hệ số biến thiên (RSD%):

Độ thu hồi của phương pháp: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Trong đó:

xi :Giá trị của mẫu thứ i x¯: Giá trị trung bình của mẫu N: Số lần thêm chuẩn

n: Số lần chạy lặp V: Thể tích cuối (ml) m: Khối lượng mẫu (g)

Cm+c : Nồng độ vitamin B1 xác định được trong mẫu thêm chuẩn (mg/kg)

Cm: Nồng độ vitamin B1 có trong mẫu (mg/kg) mc: Lượng vitamin B1 thêm vào (µg)

PHẦN III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định vitamin B1

bằng HPLC

3.1.1. Lựa chọn detector và bước sóng phát hiện

Vitamin B1 không có tính chất phát huỳng quang nhưng khi được dẫn xuất với Kali ferricyanid (K3Fe(CN)6) trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm phát huỳnh quang thiocrom. Chúng tôi đã tiến hành dẫn xuất vitamin B1 với dung dịch dẫn xuất K3Fe(CN)6 theo lược đồ sau:

Lược đồ II. Quy trình dẫn xuất chuẩn vitamin B1

Dẫn xuất được phân tích trên thiết bị HPLC, detector RF với bước sóng kích hoạt λex= 366nm, bước sóng phát xạ λem = 435nm với độ chọn lọc cao.Vì vậy chúng tĩi chọn detector huỳnh quang để xác định vitamin B1

trong gạo.

3.1.2. Lựa chọn cột tách

Cột tách là trung tâm của quá trình sắc ký. Tham khảo tài liệu [19] có thể sử dụng cột C18 để tách và định lượng vitamin B1. Để phù hợp với điều

Hút chính xác 200µl chuẩn làm việc

+ 200µl dung dịch dẫn xuất K3Fe(CN)6 Vial

HPLC

kiện phòng thí nghiệm, trong thời gian tiến hành đề tài chúng tơi đã lựa chọn cột Symmestry Water C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) và giữ không đổi trong những lần khảo sát sau. Kết quả phân tích được chỉ ra trong hình 3.1.4.

50 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 V o lt s 0 .0 0 0 0 .0 0 5 0 .0 1 0 0 .0 1 5 0 .0 2 0 V o lt s 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 B 1 6 .5 7 5 2 0 1 3 9 3 7 6 9 5 2

Detector A (Ex:366nm, Em:435nm) Vitamin B1 Std 0.1273 ppm TF0.8.dat Name Retention Time Height Area

Hình 3.1.4: Sắc đồ Vitamin B1 sử dụng cột Symmestry Water C18

(250mm × 4,6mm × 5µm)

3.1.3. Lựa chọn pha động

Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc ký. Thành phần pha động có ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả tách sắc ký. Nhìn chung, pha động có thể ảnh hưởng đến: độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu trữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký.Thành phần pha động khác nhau thì độ phân cực cũng khác nhau. Chúng tôi thay đổi tỉ lệ các chất trong pha động để tìm ra thành phần pha động cho kết quả phân tích tối ưu nhất. Cố định các điều kiện chạy sắc ký:

o Cột Symmestry Water C18 (250mm × 4,6mm × 5µm)

o Pha động: Kênh A: Đệm acetat (0,05M, pH=4,5), kênh B: MeOH

o Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

o Nhiệt độ cột: 35oC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

o Detector: RF ( Ex= 366nm, Em = 435nm )

Bảng 3.1.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động Thành phần pha động(%) Thời gian lưu (phút) Kết quả Kênh A Kênh B 100 0 Khụng cú pic (tR >20 phút) Minutes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 V ol ts -0 .0 00 1 0. 00 00 0. 00 01 V ol ts -0.0001 0.0000 0.0001

Detector A (Ex:366nm, Em:435nm) Vitamin B1

Std0.65ppm-TF 0.8-100%A xuoi 02.dat

Name Retention Time Height Area 90 10 9,0 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 V ol ts 0. 00 0 0. 00 5 0. 01 0 0. 01 5 V ol ts 0.000 0.005 0.010 0.015 V it am in B 1 8 .9 08 1 50 42 3 26 69 6

Detector A (Ex:366nm, Em:435nm) Vitamin B1 Std 0.65ppmTF 0.8 _90%A.dat Name Retention Time Height Area 75 25 6,3 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 V o lt s 0 .0 0 0 .0 2 0 .0 4 0 .0 6 V o lt s 0.00 0.02 0.04 0.06 V it a m in B 1 6 .2 6 7 6 1 5 0 7 1 2 1 8 4 7 7

Detector A (Ex:366nm, Em:435nm) Vitamin B1 Std 0.65ppmTF 0.8.dat Name Retention Time Height Area 50 50 4,3 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 V o lt s 0 .0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4 V o lt s 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 V it am in B 1 4 .2 5 8 4 3 6 1 33 5 5 0 6 02 5

Detector A (Ex:366nm, Em:435nm) Vitamin B1 Std 0.65ppmTF 0.8 _50% A.dat Name Retention Time Height Area

Nhận xét: Khi tăng tỉ lệ MeOH thì thời gian lưu giữ của chất phân tích

B1 ra sớm quá sẽ lẫn với tạp chất khi phân tích mẫu thực tế. Khi tỉ lệ MeOH giảm, thời gian lưu giảm, Vitamin B1 ra muộn gây doãng pic và sẽ làm giảm độ nhạy của phương pháp phân tích. Để đảm bảo tách Vitamin B1 khỏi các chất ảnh hưởng khác và định lượng nó dễ dàng, chúng tôi quyết định chọn thành phần pha động là 75%A : 25%B và giữ không đổi trong những lần khảo sát sau.

3.1.4. Khảo sát tốc độ dòng

Tốc độ pha động cũng góp phần ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký vì nó liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh và pha động. Khi tốc độ pha động nhỏ chất phân tích ra muộn, gây doãng pic và tốn dung môi. Khi tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu chưa kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tượng chồng pic. Chúng tôi khảo sát tốc độ dòng trong khoảng 0,5 ÷ 1 ml/phút. Cố định các điều kiện chạy:

o Cột Symmestry Water C18 (250mm × 4,6mm × 5µm)

o Pha động: Đệm acetat (0,05M; pH=4,5): MeOH (75:25)

o Nhiệt độ cột: 35oC

o Detector: RF ( Ex= 366nm, Em = 435nm )

o Mẫu phân tích: Dẫn xuất chuẩn vitamin B1 0,50ppm Mỗi mẫu chạy lặp 3 lần và lấy kết quả trung bình

Bảng 3.1.3: Khảo sát tốc độ pha động

Tốc độ dòng (ml/phút) Thời gian lưu (phút) Chiều cao pic Diện tích pic

0,5 7,8 370186 8988152

0,8 6,2 369751 8956511

Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 V o lt s 0 .0 0 0 .0 1 0 .0 2 0 .0 3 0 .0 4 0 .0 5 0 .0 6 V o lt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 B 1 6 .2 4 2 6 1 7 9 5 9 9 2 3 2 5

Detector A (Ex:366nm, Em:435nm) Vitamin B1 Std 0.5092ppm TF0.8.dat Name Retention Time Height Area

Hình 3.1.5: Sắc đồ chạy chuẩn 0,50 ppm tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút.