Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép thiamin hoặc hợp chất tạo dẫn xuất của thiamin được tách trên cột thích hợp của sắc ký lỏng hiệu năng cao và được dò bằng đầu dò UV, huỳnh quang.
1.4.6.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detector PDA[28]
Mẫu sau khi acid hoá bằng Trichloracetic, thu dịch chiết chứa vitamin B1, tiêm dịch vào hệ thống máy HPLC với điều kiện detector PDA, bước sóng 246nm. Pha động là đệm phosphate (pH=3): ACN và chương trình gradient, cột Symmestry Water C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)
1.4.6.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector huỳnh quang (RF).
Sở Khoa học thực phẩm, Đại học College Dublin đã ứng dụng phương pháp HPLC để xác định vitamin B1 trong thịt, các sản phẩm từ thịt. Vitamin B1 được tách từ các loại thịt bởi quá trình thuỷ phân với HCl 0,1N, sau đó là quá trình thuỷ phân bằng enzyme, giúp phosphoryl hoá các dạng phosphate ester của vitamin B1. Các enzyme sử dụng cú hoạt động phosphatase, cú nguồn gốc từ lúa mỡ. Tác giả đã lựa chọn enzyme diastase, enzyme loại này cú sự hoạt động của hỗn hợp nhiều enzyme: Amylase, protease và phosphatase. Sau khi vitamin B1 bị oxi hoá thành thiocrom và phân lớp trong isobutanol, dịch chiết vitamin B1 sẽ được đem phân tích trờn máy HPLC với pha tĩnh là cột C18, pha động là methanol: nước, bước sóng kích hoạt 450nm, bước sóng phát xạ 510nm. [27]
Vào năm 1987, viện kiểm nghiệm thực phẩm của Pháp đã tiến hành xác định hàm lượng vitamin B1 trong một số mẫu thực phẩm (nấm men, hạt ngũ cốc, bỏnh qui) bằng phương pháp sắc kí lỏng, sử dụng đầu dò huỳnh quang. Với các mẫu thực phẩm chức năng, tỉ lệ thu hồi của phương pháp luơn trờn 89%, chỉ ngoại trừ mẫu thực phẩm cú chứa chocolate thì tỉ lệ này là xấp xỉ 50%. Mặc dự điều đó là một bất lợi thì việc xác định hàm lượng vitamin B1
bằng phương pháp sắc ký lỏng vẫn được cụng nhận là phương pháp tốt nhất. [16]
Vỡ vậy, AOAC đã xây dựng phương pháp chính thức để xác định vitamin B1 trong thức ăn cho người và gia súc, trong sữa cho trẻ sơ sinh bằng HPLC với detector RF.Với mẫu thực phẩm được xử lớ qua các bước: thuỷ phân bằng acid, bổ sung enzyme thuỷ phân, oxi hoá thiamin thành thiocrom, chiết thiocrom bằng isobutanol. Mẫu thực phẩm khụng chứa thiamin ở dạng phosphate ester, dạng liân kết với protein thì khơng cần bổ sung enzyme thuỷ phân. [14], [15].
Trờn thế giới, cú nhiều đối tượng thực phẩm đã phân tích vitamin B1
bằng phương pháp HPLC như [25]: xác định vitamin B1 trong thực phẩm dành cho người ăn kiêng, với thành phần pha động là Methanol: Natriacetat (pH=4,5) tỉ lệ (60:40), cột C18, bước sóng kích hoạt 366nm, bước sóng phát xạ 435nm. Trong các sản phẩm thịt, với pha động là Chloroform: Methanol tỉ lệ (90:10), cột Spherisorb Silica (50×0.21cm), bước sóng kích hoạt 367nm, bước sóng phát xạ 418nm. Trong ngụ, với pha động là đệm citrate 0,1N (pH=7): Methanol tỉ lệ (65:35), cột nucleosil- 5 C18 (15×0,46cm).
Thiamin được dẫn xuất với K3Fe(CN)6 trong mĩi trường kiềm tạo ra thiocrom. Dẫn xuất được phân tích trên thiết bị HPLC, detectơ huỳnh quang với bước sóng kích hoạt λex= 365nm, bước sóng phát xạ λem = 435nm. Phương pháp này có ưu điểm là loại được ảnh hưởng của nền mẫu, có độ chọn lọc và độ nhạy cao, được áp dụng rộng rói trong các viện kiểm nghiệm thực phẩm trờn thế giới.Tuy nhiên mặt hạn chế của phương pháp là giá thành cao và phải đầu tư lớn.
Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này với điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector RF để xác định hàm lượng Vitamin B1 trong gạo sau khi gạo đã được thuỷ phân bằng enzyme.
PHẦN II
ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU