- Kiểm tra cây tiến hóa (giá trị bootstrap, chiều dài cây…) 5 Hiển thị kết quả cây phát sinh loài (treeview).
3.2.1.2. Phân tích trình tự vùng ITS
Trình tự ITS của 25 mẫu ngải (xem thêm phụ lục C) được phân tích cùng với 25 trình tự ITS trên GenBank. Như vậy, tổng cộng có 53 trình tự ITS được phân tích, gồm 50 mẫu nhóm trong (trong đó có 25 mẫu thực nghiệm) và 3 mẫu thuộc nhóm ngoài (để dùng dựng cây phát sinh loài có gốc). Nhóm ngoài có ý nghĩa quan trọng đáng kể, làm tăng độ chính xác của cây tiến hóa. Nhóm ngoài được chọn có quan hệ gần nhất với nhóm đang được phân tích (Bảng 2.1). Theo các nghiên cứu trước đây về họ Gừng thuộc các tông Globbeae, Hedychieaevà Zingibereae của Kress và cộng sự (2002, 2004, 2005) [22], [23], [44] chúng tôi chọn 3 trình tự thuộc tông
Siphonochilus làm nhóm ngoài. Ba loài này tuy nằm ngoài nhóm mẫu nghiên cứu nhưng chúng vẫn thuộc họ Gừng, thích hợp cho việc so sánh trình tự ở các bước tiếp sau và không ảnh hưởng đến kết quả phân tích [27].
Chiều dài trình tự vùng ITS trung bình dài khoảng 634 bp, đều rơi vào nhóm trong. Chiều dài trung bình nhóm ngoài là 618 bp (Bảng 3.4). Các trình tự này sau khi gióng hàng theo chương trình clustal - W (Mega 4.0) được đồng nhất hóa mẫu (chọn những điểm đồng nhất). Ma trận gióng hàng được tạo ra gồm 53 cột với 254 hàng tương ứng với 53 trình tự, mỗi trình tự dài 254 bp.
Theo mô hình ước lượng trung bình, tần số 4 loại nucleotide tính trên toàn bộ ma trận là khá cân bằng T = 25,54%; C = 26,4%; A = 20.82% và G = 27.25%. Có 194/254 vị trí biến đổi, chiếm 76,38%. Có 109/254 vị trí cho thông tin hà tiện (parsimony), chiếm 42,91%. Có 60/254 vị trí bảo tồn, chiếm 23,62 %. Các tỉ số R(a) [AC] = 1,0000; R(b) [AG] = 1,5475; R(c) [AT] = 1,0000; R(d) [CG] = 1,0000; R(e) [CT] = 3,7428 và R(f) [GT] = 1,0000 cho thấy tỉ lệ biến đổi xảy ra giữa các nucleotide A và C; A và T; C và G; G và T là tương đương nhau. Tỉ lệ biến đổi xảy ra cao giữa các nucleotide A và G (purine); và cao nhất giữa các nucleotide C và T (pyrimydine). Mô hình tiến hóa được chọn là TrNef+G (tần số base cân bằng, tỉ lệ biến đổi AC=AT=CG=GT, AG, CT; hệ số gamma = 1,5200).