3.3.1.1 Nguyên liệu
Phế liệu của các trích Trung Quốc (Tenualosa ilisha) cung cấp bởi các phân xƣởng chế biến surimi ở địa phƣơng đƣơccj sử dụng để làm gelatin cá. Gelatin cá thƣơng mại (CFG) đƣợc cung cấp bởi Công ty Trách nhiệm Hữu Hạn Croda Colloid (Chesire, UK), và gelatin bò giết mổ (HBG) đƣợc thu nhận từ công ty địa phƣơng (Halalgel Sdn Bhd) ở Malaysia. Tất cả các hóa chất đƣợc sử dụng thuộc loại hóa chất cho phân tích. Transglutaminase vi sinh vật đƣợc cung ứng bởi công ty Ajinomoto, Nhật (Activa TG- S, Japan) với hoạt tính là 100 U/g bột theo thông tin đƣợc cung cấp bở công ty Ajinomoto.
3.3.1.2 Trích ly gelatin
Gelatin cá đƣợc trích ly từ phê liệu quá trình chế biến surimi bằng phƣơng pháp đƣợc mô tả có sự điều chỉnh nhẹ (Zhou và Regenstein, 2005). Quá trình trích ly đƣợc thực hiện xuyên suốt chuỗi các công việc tiền xử lý, đƣợc giữ ở dƣới 100C với )
Ca(OH)2 0.2M (phế liệu cá: Ca(OH)2 = 1:6) trong 1h, sau đó là acid citric 0.1M (phế liệu cá:acid citric = 1:6) trong 3h. Cuối cùng trích lý với nƣớc cất (phế liệu cá:nƣớc = 1:2) trong 3h ở 500C và công đoạn rửa với nƣớc đƣợc thực hiện sau môi thao tác xử lý. Dịch trích, sau đó đƣợc lọc với vải lọc bơ và đƣợc sấy trong lò ở nhiệt độ 700C.
3.3.1.3 Chuẩn bị gel gelatin
Gel gelatin đƣợc chuẩn bị theo một quy trình tƣơng tự nhƣ đƣợc mô tả bởi Fernandez-Diaz và cộng sự (2001). Các mẫu gel gelatin đƣợc trích ly từ gelatin cá (HBG) đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan 6.67% (w/v) bột gelatin vào trong nƣớc cất ở nhiệt độ phòng và giữ trong 30 phút và sau đó gia nhiệt lên 600C trong bể điều nhiệt 30 60 phút cho đến khi gelatin đƣợc hòa tan hoàn toàn. Dung dịch gelatin sau đó đƣợc làm nguội về 250C, và tiếp tục đƣợc làm lạnh ở 5 70Ctrong vòng 16 18 h trƣớc khi phân tích. Ảnh hƣởng của transglutaminase vi sinh vật lên tính chất gel của gelatin trích ly từ cá đƣợc điều tra bằng cách thêm enzyme này vào các mẫu gelatin với các nồng độ là 0.5, 1.0, 3.0, và 5.0 mg/g gelatin. Dung dịch gelatin với enzyme đƣợc ủ tại nhiệt độ 500C trong 15 phút, thỉnh thoảng khuấy và sau đó làm nguội về nhiệt độ phòng trƣớc khi bảo quản ở 5 70C trong 16 18h rồi đem phân tích.
3.3.1.4 Xác định pH của dung dịch gelatin
Phƣơng pháp viện nghiên cứu tiêu chuẩn Anh (British standard institute method – BSI 757, 1975) đƣợc dùng để xác định pH của dung dịch gelatin. Dung dịch gelatin (1% w/v) đƣợc tạo thành bằng cách hòa tan bột gelatin vào nƣớc cất trong 30 phút sau đó gia nhiệt lên 600C trong 30-60 phút và tiếp tục làm nguội trƣớc khi đo pH với pH kế (CyberScan 2500) EUTECH, Singapore.
3.3.1.5 Xác định độ bền gel
Trị số bloom của gel gelatin đƣợc xác định theo tiêu chuẩn Anh (BSI 757, 1975). Gel gelatin đƣợc chuẩn bị nhƣ đã mô tả trên đây trong phần 2.3. Dung dịch gelatin sau đó đƣợc làm nguội về 250C và đƣợc đổ vào bình đo bloom. Bình đo bloom đƣợc giữ lạnh ở 5-70C trong 16-18h trƣớc khi đo độ bloom. Máy phân tích cấu trúc TA XT2 (Stable Microsystems, Surrey, UK) đƣợc dùng để xác định độ bền gel với load cell 5kg và con trƣợt (cross-head) chuyển động với tốc độ 1mm/s với đầu đẩy đáy phẳng có đƣờng kính 0.5. Trị số bloom (g) sẽ đạt đƣợc sau khi đầu đẩy đam xuyên vào gel với chiều sâu 4mm. Ở chiều sâu này, lực cực đai đọc đƣợc (chống lại sự đâm xuyên) sẽ đƣợc ghi lại và chuyển thành độ bloom (g) của gel. Mỗi mẫu sẽ đƣợc thử 3 lần. Suất Young (Young module) cũng đƣợc xác định từ trị số độ bền gel cho gelatin.
3.3.1.6 Xác định phân tử lượng bằng SDS-PAGE
Quy luật chuỗi protein của EFG, CFG và HBG và dấu hiệu của các liên kết ngang cảm ứng bởi transglutaminase giữa các tiểu phần gelatin đuwọc phân tích bằng cách sử dụng (SDS-PAGE) (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) theo phƣơng pháp Laemmli (1970). Các mẫu (1g) đƣợc hòa tan vào trong 10 ml SDS 5% (w/v) thành dung dịch. Hỗn hợp sẽ đƣợc gia nhiệt tại 950C trong 1h trong bể điều nhiệt. Các mẫu sẽ đƣợc li tâm với tốc độ 3000g trong vòng 3 phút và các phần nổi ở trên sẽ thu lại và trộn với đệm mẫu (hệ đệm Tris – HCl 0.5 M, pH 6.8) chứa 5 % (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol và 10% (v/v) - mercaptoethanol ở tỷ lệ 1:1 (v/v) sử dụng 4% gel xếp lớp và 7.5% gel hòa tan. Các mẫu đƣợc chạy ở 20 mA trong Mini PROTEAN Tetra Cell Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc. CA), gel sẽ đƣợc nhuộm với with Biosafe Coomassie G250 Stain. Thể tích đem chạy là 15 ml cho tất cả quy trình. SDS-PAGE Tiêu chuẩn (BIO-RAD), Prestained SDS-PAGE Standards Broad Range (catalog 161-0318) đƣợc dùng để nhận diện các phân đoạn protein với phân tử lƣợng dao động từ 6 198 kDa.
3.3.1.7 Đo đạc lưu biến
Lƣu biến kế kiểm soát áp lực (AR 1000 TA Instrument, USA) đƣợc sử dụng để mô tả các đáp ứng về mặt lƣu biến của dung dịch gelatin sử dụng hình cone – plate (40 mm, góc = 20, và khoảng trống là 52 m). Các phép thử dao động nhỏ cũng đƣợc thực hiện. Các tính chất nhớt dẻo của dung dịch gelatin (6.67% w/ v) đƣợc đo đạt trong khoảng 5 400C (quét nhiệt) và 40 50C (quét nguội) với tốc độ gia nhiệt/làm nguội là 10C/phút. Tần số của dao động là 1 Hz và áp lực càn cung cấp là 3 Pa. Module đàn hồi ( ) và module nhớt ( ) và góc pha (tang ) đƣợc biểu diễn dƣới dạng hàm của nhiệt độ.
3.3.1.8 Phép đo nhiệt lượng quét vi sai
Các tính chất nhiệt của gelatin đƣợc xác định bằng cách dùng phép đo nhiệt lƣợng quét vi sai. Đo đạc bằng máy TA Instruments Calorimeter Q100 (TA Instruments Ltd., Leatherhead, UK). Hệ thống làm lạnh (RCS - refrigerated cooling system) đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ để tạo ra nhiệt độ -100C và tế bào DCS nitơ (nitrogen DSC cell) làm sạch ở mức 50 ml/phút. Các khay nhôm kín cũng đƣợc sử dụng. Lƣợng gel gelatin (gần 10mg) đƣợc đặt vào khay kín bằng nhôm và gia nhiệt -10 400C, tốc độ 50C/phút. Sử dụng một khay trống để đối chiếu và thiết bị đƣợc chuẩn độ với indium (Tm = 156.60C và enthanpy ). Nhiệt độ chuyển xoắn thành cuộn (Tm) là nhiệt độ có đƣợc khi đỉnh thu nhiệt xảy ra và enthanpy ( của quá trình chuyển sol thành gel đƣợc xác định bằng diện tích vùng trên đỉnh thu nhiệt. Đỉnh thu nhiệt đƣợc xác định bởi nhiệt độ chảy của gel gelatin trong suốt quá trình “vạch gia nhiệt” (heating
trail) và đỉnh tỏa nhiệt trong các “vạch làm nguội” (cooling trail) đƣợc xác định bằng nhiệt độ tạo gel.
3.3.1.9 Phân tích thống kê
SPSS 12.0 đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này để phân tích dữ liệu. Phân tích phƣơng sai một chiều đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng phép thử Duncan với mức ý nghĩa p 0.05.
3.3.2Kết quả và bàn luận
3.3.2.1 Độ bền gel
Độ bền gel của các mẫu gelatin da cá (6.67% w/v) đƣợc đƣa ra trong Hình 3.7.
Hình 3.7 Độ bền gel gelatin của da cá trích ly (EFG), gel gelatin bò (HBG) và gel
gelatin cá thƣơng mại (CFG). Giá trị trung bình ± SD từ các mẫu đƣợc đo 3 lần. Độ bền của gelatin da cá trích ly (69.04 g) thấp hơn đáng kể (p <0.05) so với gelatin bò (336.2g) và gelatin cá thƣơng mại (435.9 g). Độ bền gel thấp của gelatin cá có thể là vì hàm lƣợng proline và hydroxyproline thấp, điều này đã tạo các cấu trúc xoắc bậc 3 ít hơn. Sự khác nhau của những gelatin ở độ bề gel có thể vì các đặc tính nội tại, chẳng hạn thành phần chuôi protein (sự phân bổ khối lƣợng phân tử) và hàm lƣợng các acid amin cũng nhƣ loại phƣơng pháp xử lý trích ly. Proline và hydroxyproline đƣợc cho là nguyên nhân dẫn đến độ bền của xoắn bậc 3 của cấu trúc
collagen thông qua các liên kết hydro giữa các phân tử nƣớc và nhóm hydroxyl của hydroxyproline trong gelatin (Burjandze, 1979; Ledward, 1986; Fernandez-Diaz và cộng sự, 2001). Suất Young (E) của các mẫu gelatin có đƣợc thông qua các giá trị độ bền gel đƣợc liệt kê trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5 Suất Young (E) của EFG, HBG, CFG.
Mẫu Nồng độ enzyme (mg/g gelatin) Suất Young E (104 N/m2) EPG EPG EPG EPG EPG HBG CFG 0 0.5 1.0 3.0 5.0 Không xử lý Không xử lý 6.68 0.44 8.03 1.28 9.78 0.94 8.76 1.25 7.26 0.65 32.5 0.58 42.2 1.13
Các giá trị suất Young đƣợc cho bằng giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn (SD). Các giá trị chú trích bằng các ký tự trên mỗi con số không khác nhau đáng kể (p 0.05).
3.3.2.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung enzyme transglutaminase lên độ bền gel:
Hình 3.8 cho thấy độ bền gel của các gel làm từ gelatin da cá trích ly với các nồng độ transglutaminase khác nhau. Bảng 3.5 cho thấy các giá trị suất Young, các giá trị này có đƣợc từ các trị số độ bền gel của các mẫu gelatin. Nói chung, với việc thêm vào EFG transglutaminase, độ bền tăng lên. Độ bền tăng đáng kể (p < 0.05) với nồng độ 1 mg/kg cho độ bền gel là 101.1 g so sánh với mẫu không có enzyme là 69.03. Việc tăng lên nồng độ enzyme quá 1mg/kg sẽ làm độ bền gel giảm. Điều này xảy ra là do liên kết ngang nhiều quá mức làm thấp độ bền gel thông qua việc cản trở các liên kết liên phân tử và từ đó làm giảm đi sự tạo thành các mạng lƣới gel (Jongjareonrak và cộng sự, 2006; Gomez-Guillen, Sarabaia, Solas và Montero, 2001). Gomez-Guillen và cộng sự (2001) cũng báo cáo rằng việc thêm enzyme transglutaminase vƣợt quá một nồng độ nào đó sẽ gây ra sự giảm xuống về độ bền gel vì sự hình thành quá mức các liên kết cộng hóa trị xúc tác bởi enzyme transglutaminase, gây ra sự hình thành các liên kết cộng hóa trị nội phân tử. Ledward (1986) cũng đã báo cáo rằng sự giảm xuống độ bền gel là vì sự tăng lên sự tạo thành các liên kết cộng hoa trị do enzyme này, cho nên đã làm cản trở sự kết hợp liên phân tử dẫn đến làm giảm sự thành lập mạng lƣới gel.
Hình 3.8 Độ bền gel của EFG khi có và không có enzyme transglutaminase. Giá trị trung bình ± SD từ các mẫu đƣợc tiến hành lặp 3 lần.
3.3.2.3 Giá trị pH của các mẫu gelatin
Các giá trị pH của các mẫu gelatin EFG, CFG và HBG đƣợc cho ở Bảng 3.6. pH của dung dịch EFG thấp hơn pH của CFG và HBG.
Bảng 3.6 Các điểm tạo và tan chảy gel từ các lần chạy DSC và lƣu biến học và các trị
pH của EFG, CFG và HBG.
EFG CFG HBG
Điểm nóng chảy, oC (DSC) 16.2 0.2 23.74 0.7 26.5 1.2 Điểm tạo gel, oC (DSC) 5.27 0.4 11.87 1.1 12.6 3.1 Điểm nóng chảy, oC (lƣu
biến) 16.7 0.1 25.56 0.8 28.70 0.4 Điểm tạo gel, oC (lƣu biến) 5.1 0.1 17.46 0.2 19.33 0.5 pH 4.47 0.02 5.45 0.03 5.89 0.01 Các giá trị đƣợc cho bằng giá trị trung bình ± SD. Các chú thích viết trên mỗi ký tự
3.3.2.4 Sự phân bố khối lượng phân tử
Hình 3.9 Quy luật protein của gel gelatin từ EFG có và không có enzyme
transglutaminase. CFG và HBG: (a. chất chuẩn, b. HBG, c. CFG, d. EFG và các ký tự e, f, g, h biểu thị cho EFG có bổ sung nồng độ enzyme theo thứ tự là 0.5, 1, 3 và 5
mg/g protein.
Các quy luật chuỗi protein của của gelatin phế liệu cá trích ly (EFG), CFG, HBG và EFG đƣợc xử lý với transglutaminase cho trong Hình 3.9. Ta thấy các chuỗi α1 mờ nhạt, trong EFG (đƣờng d) và mẫu EFG xử lý với transglutaminase ở nồng độ 0.5 mg/g (đƣờng e). Các dải protein có cƣờng độ khá lớn đƣợc quan sát xung quanh 53 kDa trong cả những mẫu này. Tuy nhiên, các phân đoạn có phân tử lƣợng thấp hơn khác có thể vẫn đƣợc thấy mặc dù nhạt. Những dải này không xuất hiện khi nồng độ enzyme transglutaminase tăng cao hơn, có t hể thấy ở đƣờng f, g và h trên Hình 35. Kết quả đã đề nghị rằng việc không xuất hiện các dải có phân tử lƣợng cao và thâp ở gelatin trích ly xử lý với enzyme có thể vì sự phân hủy của protein trong quá trình trích ly. Các “mảnh vỡ” (fragment) gelatin bị phân hủy có liên hệ với độ nhớt thấp, điểm tan gel thấp, điểm tạo gel thấp, thời gian tạo lâu và sự tăng lên độ bloom (Ledward, 1986; Muyonga, Cole và Duodu, 2004). Muyonga và cộng sự (2004) đã kết luận gelatin da từ cá pecca Nile có chứa các peptide có phân tử lƣợng thấp khi gelatin đƣợc trích ly ở nhiệt độ cao. Jongjareonrak và cộng sự đã đề xuất rằng khối lƣợng phân tử thấp hơn các chuỗi α đƣợc quan sát ở cá gelatin da cá chỉ vàng bigeye, đƣợc so sánh với gelatin da cá hồng sọc nâu vì sự có mặt của proteinase, điều này có thể gây ra sự phân hủy protein trong suốt quá trình trích ly. Khi nồng độ transglutaminase tăng cao hơn 0.5 mg/g, các dải hầu hết không xuất hiện, điều này có thể là do các liên kết ngang thông qua sự hình thành các liên kết cộng hóa trị không có cầu disulfide cảm ứng bởi
transglutaminase nhƣ đã đƣợc báo cáo bởi Folk (1983). Những sự phát hiện này là phù hợp với những báo cáo của Jongjareonrak và cộng sự (2006), tuy nhiên, họ sử dụng nồng độ enzyme thấp hơn nhờ đó, nồng độ cao nhất của họ là 0.05% trong khi đây chỉ là nồng độ ban đầu của các tác giả viết bài báo này (ở đƣờng e, hình 35).
3.3.2.5 Các tính chất nhớt dẻo
Mô tả về tính chất nhớt dẻo động lực học của các mẫu gelatin bằng quét nhiệt (5 400C) và quét nguội (40 50C) đƣợc mô tả ở hình 3.10 và hình 3.11.
Hình 3.10 Quét nhiệt lƣu biến từ 5 400C của EFG (□), CFG (■) và HBG (▼), (a)
Hình 3.11 Quét nguội lƣu biến (40 50C) của EFG (□), CFG (▼) và HBG (■),(a) storage ( ) và (b) loss modulus ( ).
Nói chung, các giá trị storage modulus ( ) lớn hơn so với loss modulus ( ) trong cả quét nhiệt và quét lạnh và EFG cho thấy giá trị ( ) và ( ) thấp hơn so với CFG và HBG. Các nhiệt độ tan chảy của các mẫu gel lần lƣợt là 16.7, 25.5 và 28.70C đối với EFG, CFG và HBG, nhƣ đã đƣợc chỉ ra từ các điểm cắt nhau của ( ) và ( ) trong mô tả tính chất nhớt dẻo. Bảng 40 tổng hợp các kết quả của nhiệt độ tạo và tan chảy gel của các mẫu gelatin đạt đƣợc từ các lần chạy DSC và lƣu biến. Hình 38 và hình 39 cho thấy các mô tả dao động của EFG có và không có (có điều khiển) thêm vào transglutaminase. Module đàn hồi ( ) và module nhớt ( ) của gelatin trong phƣơng pháp quét nhiệt tăng lên 2.5 lần khi có enzyme transglutaminase với nồng độ 1 và 3 mg/g, tuy nhiên, với việc thêm enzyme này hơn 5 mg/g, cả 2 module ( ) và ( )
mg/g gây ra sự giảm tính chất nhớt dẻo khi so sánh với các mẫu có bổ sung 1 và 3 mg/g enzyme. Tuy nhiên việc thêm transglutaminase với nồng độ 0.5 mg/g làm giảm cả ( ) và ( ) khi so sánh với khi có điều khiển. Tƣơng tự, trên đồ thị quét nhiệt (Hình 3.12), việc thêm vào enzyme làm tăng ) và ( ) nhƣng ở hàm lƣợng nhỏ enzyme này thêm vào (0.5 mg/g), gel sẽ không đƣợc hình thành ở 50C và đó là do ít xuất hiện các liên kết ngang hơn làm ngăn cản sự hình thành của liên kết hydro và vì thế, điểm tạo gel của gelatin bị giảm xuống. Nhiệt độ tạo và tan chảy gel cũng có thể tăng khi bổ sung enzyme với lƣợng lớn hơn 1mg/g (Bảng 3.7). Các nhiệt độ tạo gel đƣợc quan sát ở phƣuơng pháp quét nguội đã cho thấy sự tăng lên nhẹ khi thêm enzyme vào.
Hình 3.12 Quét nhiệt lƣu biến từ 5 400C của EFG có và không có (điều khiển)
Hình 3.13 Quét nguội lƣu biến từ 40 50C của EFG có và không có (điều khiển) enzyme transglutaminase: (a) storage modulus ), (b) loss modulus ( ).
Bảng 3.7 Nhiệt độ tạo và tan chảy gel của EFG có và không có (điều khiển) enzyme transglutaminase.
Nồng độ enzyme transglutaminase (mg/g) thêm vào EFG
0 0.5 1.0 3.0 5.0
Điểm nóng chảy, oC
(DSC) 16.2 0.2 16.7 1.2 19 0.7 17.5 0.4 18.9 0.7 Điểm nóng chảy, oC
(lƣu biến) 16.7 0.1 16.3 0.4 17.3 0.1 17.1 0.1 17.5 0.5 Điểm tạo gel, oC
(lƣu biến) 5.1 0.1 Không tạo gel 5.7 0.1 5.5 0.7 5.2 0.1 Các giá trị đƣợc cho bằng giá trị trung bình ± SD. Các chú thích viết trên mỗi ký tự trong mỗi hàng không khác nhau đáng kể (p < 0.05).
3.3.2.6 Các tính chất nhiệt
Phƣơng pháp đo nhiệt lƣợng quét vi sai, quét nhiệt (-10 400C) và quét nguội (40 - 100C) thực hiện với tốc độ 50C/phút, nồng độ các mẫu gel là 6.67 (w/v) của EFG, CFG, HFG đƣợc cho ở Hình 3.14 và Hình 3.15, theo thứ tự. Nhiệt độ tan đƣợc quan sát từ giá trị cực đại của các đỉnh thu nhiệt trong biểu đồ nhiệt DSC. Ta thấy nhiệt độ tan chảy cao nhất là ở HBG, đƣợc so sánh với CFG.
Hình 3.14 Đƣờng cong DCS trong các lần chạy gia nhiệt từ -10 400C: ( ) EFG, ( )