ADN tổng số được chiết tỏch theo cải tiến của khoa Cụng nghệ sinh học. Sau đú, chỳng tụi tiến hành kiểm tra độ nguyờn vẹn và tinh sạch của ADN tổng số theo phương phỏp điện di trờn gel agarose 1%. Kết quả cho thấy tất cả cỏc băng ADN đều gọn và rừ nột (hỡnh 1). Điều đú đảm bảo độ nguyờn vẹn và tinh sạch của ADN cú thể tiến hành phản ứng PCR để xỏc định sự cú mặt của gen tms2.
Thứ tự cỏc giếng 1.T1S-96, 2. IR24, 3. 103S, 4. 64S, 5. 25S, 6. Pải 64S, 7. 287S, 8. Kim 76S, 9.TH3-3- 12, 10. Việt lai 24- 14
Hỡnh 1: Ảnh diện di kiểm tra độ nguyờn vẹn cà tinh sạch của ADN 4.1.2. Xỏc định gen tms2 trờn cỏc dũng TGMS
Hiện nay cú rất nhiều dũng TGMS tuy nhiờn chỳng tụi chưa biết chỳng chứa gen tms nào. Bởi vậy, để phục vụ cụng tỏc chọn tạo giống lỳa lai hai dũng chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu cỏc dũng TGMS sau: 103S, 64S, T1S96, 287S, Kim 76S, 36S2, Pải 64S và 25S. Để biết cỏc dũng TGMS này chứa gen
tms nào chỳng tụi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi sử dụng là RM11, sau
đú tiến hành điện di với thứ tự cỏc giếng là: 1. DNA leader, 2. 103S, 3. IRBB21, 4. T1S-96, 5. R3, 6. 36S2, 7. Pải 64S, 8. Kim 76S, 9. 25S, 10. 64S, 11. 287S và kết quả điện di thu được ở hỡnh 2. Qua hỡnh 2, chỳng tụi thấy cỏc dũng 103S, 64S, T1S-96, Pải 64S, đều chứa gen bất dục mẫn cảm với nhiệt độ tms2 với kớch thước khoảng 280bp, cũn cỏc dũng cũn lại khụng chứa gen tms2.
1. DNA leader, 2. 103S, 3. IR24, 4.T1S-96, 5.R3, 6.36S2, 7.Pải 64S, 8. Kim 76S, 9. 25S, 10. 64S, 11. 287S.
Hỡnh 2 Ảnh điện di phỏt hiện gen tms2 ở cỏc dũng TGMS với mồi RM11. 4.1.3. Phỏt hiện cỏ thể chứa gen tms2 ở quần thể phõn ly F2 của tổ hợp lai TH3-3 (T1S-96/R3) và Việt lai 24 (103S/IR24)
Qua kết quả thu ở trờn 4 dũng 103S, 64S, T1S-96, Pải 64S đều chứa gen tms2, nờn chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu di truyền của gen tms2 của cỏc
tổ hợp lai F1 của TH3-3 (T1S-96/R3), Việt lai 24 (103S/IR24) và quần thể phõn ly F2 của chỳng.
Theo kết quả chạy PCR cho quần thể phõn ly F2 của tổ hợp TH3-3 (T1S-96/R3). Điều tra 123 cỏ thể trong quần thể phõn ly F2 chỳng tụi thấy rằng: 31 cỏ thể thuộc dạng Tms2Tms2 (đồng hợp tử trội), 64 cỏ thể thuộc dạng
300 bp 200 bp 500 bp
Tms2tms2 (dị hợp tử) và 28 cỏ thể thuộc dạng tms2tms2 (đồng hợp tử lặn).
Hỡnh 3: Điện di sản phẩm PCR với mồi RM11trờn quần thể phõn ly F2 tổ hợp lai TH3-3 (T1S-96/R3)
Theo kết quả điện di thu được ở hỡnh 3 chỳng tụi thấy:
- Ở giếng 1: dũng bố R3 chứa gen đồng hợp tử trội (Tms2Tms2). - Ở giếng 2: dũng mẹ T1S-96 chứa gen đồng hợp tử lặn (tms2tms2). - Ở giếng 3: con lai F1 TH3-3 chứa gen dị hợp tử (Tms2tms2).
Cỏc giếng cũn lại chứa cỏc cõy của quần thể phõn ly F2 thỡ cú 3 kiểu gen khỏc nhau:
- Ở giếng 9, 11: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen đồng hợp tử lặn tms2tms2. - Ở giếng 5, 6, 10: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen dị hợp tử Tms2tms2. - Ở giếng 4, 7, 8: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen đồng hợp tử trội
Tms2Tms2.
Tương tự với quần thể phõn ly F2 của con lai Việt lai 24 (103S/IR24) chỳng tụi tiến hành phản ứng PCR điều tra 150 cỏ thể F2 và kết quả thu được là 38 cỏ thể thuộc dạng Tms2Tms2, 79 cỏ thể thuộc dạng Tms2tms2 và 33 cỏ thể thuộc dạng tms2tms2.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1. Bố R3, 2. Mẹ T1S-96, 3. F1 (TH3-3), 4.TH3-3 – 12, 5. TH3-3 – 18, 6. TH3-3 – 27, 7. TH3-3 – 63, 8. TH3-3 – 81, 9. TH3-3 – 99, 10. TH3-3- 45, 11.TH3-3- 72
Hỡnh 4: Điện di sản phẩm PCR với mồi RM11 trờn quần thể phõn ly F2 tổ hợp lai Việt lai 24 (103S/IR24)
Theo kết quả điện di thu được ở hỡnh 4 chỳng tụi thấy:
- Ở giếng 1: dũng mẹ 103S chứa gen đồng hợp tử lặn (tms2tms2). - Ở giếng 2: dũng bố IR24 chứa gen đồng hợp tử trội (Tms2Tms2). - Ở giếng 3: con lai F1 Việt lai 24 chứa gen dị hợp tử (Tms2tms2).
Cỏc giếng cũn lại chứa cỏc cõy của quần thể phõn ly F2 thỡ cú 3 kiểu gen khỏc nhau:
- Ở giếng 5, 9, 10, 15: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen đồng hợp tử lặn
tms2tms2.
- Ở giếng 4, 6, 7, 8, 11, 12, 13: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen dị hợp tử
Tms2tms2.
- Ở giếng 14, 16, 17: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen đồng hợp tử trội
Tms2Tms2.
Để kiểm tra độ chớnh xỏc của kỹ thuật PCR chọn lọc cỏc kiểu gen TGMS (tms2) chỳng tụi đỏnh dấu những cỏ thể chọn lọc bằng PCR thụng qua chỉ thị RM11, sau đú soi hạt phấn những cỏ thể đó chọn. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.
1. Mẹ 103S, 2. Bố IR24, 3. F1(Việt lai 24), 4.Việt lai 24- 54, 5.Việt lai 24 – 18, 6.Việt lai 24- 72, 7.Việt lai 24- 81, 8. Việt lai 24- 45, 9.Việt lai 24- 27,
10. Việt lai 24- 10, 11. Việt lai 14- 125, 12. Việt lai 24- 63, 13. Việt lai 24- 44, 14. Việt lai 24- 21, 15. Việt lai 24 – 90, 16. Việt lai 24- 67, 17. Việt lai 24- 87
Bảng 3: Kết quả soi hạt phấn của quần thể phõn ly F2 trờn tổ hợp TH3-3 (T1S-96/R3 ), Việt lai 24 (103S/IR24)
Tổ hợp Kiểu gen
Số lượng cỏ thể trong quần thể
phõn ly F2 Độ chớnh xỏc (%) Số lượng cỏ thể Hữu dục Bất dục TH3-3 (T1S-96/R3) Tms2Tms2 31 30 1 96.77 Tms2tms2 64 62 2 96.87 tms2tms2 28 1 27 96.42 Việt lai 24 (103S/IR24) Tms2Tms2 38 37 1 97.36 Tms2tms2 79 76 1 96.20 tms2tms2 33 1 32 96.96 Hạt phấn bất dục (kiểu gen tms2tms2) Hạt phấn hữu dục (kiểu gen Tms2Tms2 và Tms2tms2) Hỡnh 5: Hỡnh ảnh hạt phấn dưới kớnh hiển vi
Qua bảng 3 chỳng tụi thấy ở quần thể phõn ly F2 của tổ hợp lai TH3-3 (T1S-96/R3) theo kết quả PCR cú: 31 cỏ thể đồng hợp tử trội
Tms2Tms2 cũn theo kết quả soi hạt phấn chỳng tụi thu được 30 cỏ thể hữu
dục, 1 cỏ thể bất dục; 64 cỏ thể dị hợp tử Tms2tms2, theo kết quả soi hạt phấn chỳng tụi thu được 62 cỏ thể hữu dục, 2 cỏ thể bất dục; 28 cỏ thể đồng hợp tử, theo kết quả soi hạt phấn thu được 1 cỏ thể hữu dục và 27 cỏ thể bất dục. Như vậy độ chớnh xỏc của phản ứng PCR để chọn 3 kiểu gen ở quần thể phõn ly F2
của tổ hợp TH3-3 (T1S-96/R3) lần lượt là 96.77%, 96.87% và 96.42%.
Tương tự, qua bảng 3 chỳng tụi cũng thấy độ chớnh xỏc của phản ứng PCR để chọn 3 kiểu gen ở quần thể phõn ly F2 của tổ hợp Việt lai 24 (103S/IR24) lần lượt là 97.36%, 96.20% và 96.96%.
Từ kết quả PCR và soi hạt phấn chỳng tụi thấy rằng kết quả PCR chớnh xỏc đến trờn 95%. Đõy chớnh là ưu điểm của kỹ thuật PCR, chọn nhanh và chớnh xỏc cỏc kiểu gen tms2 ngay từ giai đoạn mạ mà phương phỏp truyền thống khụng làm được.
Những cỏ thể đồng hợp lặn thu được là nguồn vật liệu rất quý để tạo dũng TGMS mới. Bằng chỉ thị phõn tử đó chọn cố định gen TGMS nờn từ những đời sau chỉ cần quan tõm đến những đặc tớnh nụng sinh học mà khụng cần quan tõm đến gen TGMS vỡ gen này sẽ khụng phõn ly nữa.
4.1.4. Nghiờn cứu di truyền gen tms2 ở quần thể phõn ly F2
Để phục vụ đắc lực cho cụng tỏc chọn tạo giống lỳa lai hai dũng chỳng tụi tiếp tục nghiờn cứu kiểu di truyền của gen tms2. Theo kết quả PCR phõn tớch trong quần thể phõn ly của hai tổ hợp TH3-3 (T1S-96/R3), Việt lai 24 (103S/IR24) chỳng tụi thấy rằng tỷ lệ phõn ly gen tms2 ở quần thể TH3-3 (T1S-96/R3) là 31 Tms2Tms2: 64 Tms2tms2: 28 tms2tms2 tỷ lệ này gần tương ứng với tỷ lệ 1 : 2 : 1 theo định luật tớnh trội của Mendel. Để chứng minh kết quả này chỳng tụi sử dụng phương phỏp thống kờ khi bỡnh phương (χ2). Theo phương phỏp này chỳng tụi cần xỏc định
=∑ − E E O TN 2 2 ( ) χ
Trong đú: O - Số liệu thực nghiệm.
E - Số liệu trụng chờ lý thuyết.
∑- Tổng theo tất cả cỏc lớp so sỏnh trong thực nghiệm. Để tiến hành kiểm định, chỳng tụi so sỏnh giỏ trị tớnh được qua thực nghiệm (χ2
TN) với giỏ trị chuẩn ở bảng χ2
nghĩa 0.05, k = n - 1, n là lớp so sỏnh, ở đõy n = 3, ta cú k = 3 - 1 = 2. Chỳng tụi cú nguyờn tắc kiểm định như sau:
χ2
TN < χ2
St- sai khỏc cú tớnh chất ngẫu nhiờn, kết quả thực nghiệm tương ứng với giả thuyết đưa ra.
χ2
TN > χ2
St- sai khỏc mang tớnh quy luật, kết quả của thực nghiệm khụng tương ứng với giả thuyết đưa ra, cần tỡm giả thuyết khỏc.
Chỳng tụi tớnh toỏn và kết quả tớnh được là χ2
TN = 0.328 và tra bảng χ2
với bậc tự do là 2 và ở mức ý nghĩa 0.05 chỳng tụi thu được χ2
St = 5.991. Từ kết quả này chỳng tụi thấy χ2
TN < χ2
St vỡ vậy cú thể kết luận sai khỏc cú tớnh chất ngẫu nhiờn, kết quả thực nghiệm tương ứng với giả thuyết đưa ra. Dú đú quần thể phõn ly F2 của con lai TH3-3 (T1S-96/R3) tuõn theo quy luật của Mendel là 1:2:1 về kiểu gen tms2.
Tương tự với quần thể phõn ly F2 của con lai Việt lai 24 (103S/IR24). Cũng tiến hành kiểm định như trờn kết quả chỳng tụi thu được là χ2
TN (= 0.72) < χ2
St (= 5.991) như vậy quần thể phõn ly F2 của con lai Việt lai 24 (103S/IR24) cũng tuõn theo quy luật của Mendel là 1:2:1 về kiểu gen tms2.
Từ phõn tớch hai quần thể trờn chỳng tụi thấy kết quả phõn ly về kiểu hỡnh ở đời F2 theo tỷ lệ 3 (Hữu dục): 1 (Bất dục) chứng tỏ tớnh trạng nghiờn cứu là do một nhõn tố di truyền (một gen) kết quả kiểm tra trựng với cỏc kết quả đó nghiờn cứu.
Như vậy sự di truyến của gen tms2 do một nhõn tố di truyền và tuõn theo quy luật tớnh trội của Mendel. Do vậy rất cú ý nghĩa đối với cụng tỏc chọn tạo lỳa lai hai dũng.
Từ kết quả của phản ứng PCR chỳng tụi chọn được cỏc cõy TH3-3 - 99, TH3-3 - 113, TH3-3 - 72, TH3-3 - 81, TH3-3 - 27, Việt lai 24 - 18, Việt lai 24 - 27, Việt lai 24 - 81, Việt lai 24 - 90 và Việt lai 24 - 10 cú kiểu gen đồng hợp tử lặn và cú kiểu hỡnh đẹp. Những cỏ thể này tiếp tục trồng và
chọn lọc sẽ tạo ra nhiều dũng TGMS mới.
4.2. Khảo sỏt ƯTL thực một số tớnh trạng chủ yếu của con lai F1 so với bố tốt nhất của chỳng tốt nhất của chỳng
Như trờn đó kết luận, dũng 103S là dũng TGMS chứa gen tms2, vụ
trước chỳng tụi đó ghộp cặp giữa 103S với rất nhiều bố tốt khỏc nhau thu được hạt lai F1. Một cõu hỏi đặt ra là cỏc tổ hợp đú cú tốt hay khụng? Cú cho ưu thế lai hay khụng chỳng tụi đó trồng hạt lai F1 và khảo sỏt ưu thế lai của chỳng.
4.2.1. Khảo sỏt ƯTL thực một số tớnh trạng nụng sinh học
4.2.1.1. Khảo sỏt ƯTL thực về chiều cao cõy cuối cựng của con lai F1 so với bố tốt nhất của chỳng bố tốt nhất của chỳng
Chiều cao cõy của lỳa lai cao hay thấp hoàn toàn phụ thuộc vào đặc điểm của bố mẹ. Tựy từng tổ hợp mà chiều cao của con lai F1 cú lỳc biểu hiện ƯTL dương (Pillai, 1961; Singh, 1978), cú lỳc nằm trung gian giữa bố và mẹ, cú khi thỡ xuất hiện ƯTL õm. Chiều cao cõy cú liờn quan đến tớnh chống đổ trờn đồng ruộng nờn chọn bố mẹ sao cho con lai F1 cú chiều cao tương đương với giống bỏn lựn cải tiến là thớch hợp nhất.
Chiều cao cõy cuối cựng cú ý nghĩa rất quan trọng đối với một số giống lỳa tốt. Tựy theo mục đớch mà người ta cú thể chọn tạo cỏc giống lỳa cú chiều cao khỏc nhau. Nhưng đối với lỳa lai hai dũng cỏc nhà chọn giống thường chọn lọc cỏc tổ hợp cú chiều cao thấp hơn so với bố của chỳng. Do đú nú cho ƯTL so với bố của chỳng thường là õm. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.
Qua bảng 4, chỳng tụi thấy chiều cao cõy cuối cựng của cỏc tổ hợp lai F1 dao động trong khoảng 63.00 - 95.00 cm và chiều cao trung bỡnh của cỏc tổ hợp lai F1
76.23 cm. Tổ hợp lai cú chiều cao cõy cuối cựng thấp nhất là 105 (103S/B3/10; 63.00 cm) và tổ hợp lai cú chiều cao cõy cuối cựng cao nhất là 121 (103S/304; 95.00 cm).
Theo bảng 4, chiều cao cõy cuối cựng của cõy bố khỏc nhau. Chiều cao cõy cuối cựng của cõy bố dao động trong khoảng 70.40 - 109.00 cm và chiều cao cõy
cuối cựng trung bỡnh là 90.15 cm. Bố cú chiều cao cõy cuối cựng thấp nhất (74.40 cm) là BB1/4 và chiều cao cõy cuối cựng của cõy bố cao nhất (109.00 cm) là T44.
Cũng theo bảng 4 chỳng tụi thấy ưu thế lai thực về chiều cao cõy cuối cựng của con lai F1 so với cõy bố tốt nhất (T44) dao động trong khoảng (-42.20%) - 12.84% và ƯTL thực trung bỡnh là (-30.07%). Như vậy tất cả con lai F1 đều thể hiện ƯTL thực về chiều cao cõy cuối cựng õm. Tổ hợp cho ƯTL thực cao nhất là (-12.84%) là 121 (103S/304), ngược lại tổ hợp lai cho ƯTL thự nhỏ nhất (-42.20%) là 105 (103S/B3/10). Điều đú cho thấy cỏc tổ hợp lai F1 ở đõy đều cú chiều cao cõy cuối cựng thấp hơn bố tốt nhất, nú cú ý nghĩa trong việc tăng cường khả năng chống đỗ cho cõy trờn đồng ruộng.
Bảng 4: Khảo sỏt ƯTL thực về chiều cao cõy cuối cựng của cỏc tổ hợp lai F1 so với bố tốt nhất của chỳng
Tổ hợp Dũng mẹ Dũng bố
Chiều cao cuối F1
(cm)
Chiều cao cuối bố (cm) HBP(%) 101 103S T69 83.00 91.80 -23.85 102 “ BB3/10 67.20 77.60 -38.35 103 “ BB4/10 65.40 74.40 -40.00 104 “ T72 68.20 83.20 -37.43 105 “ B3/10 63.00 78.00 -42.20 106 “ 10572 78.80 101.60 -27.71 107 “ BB4/5 66.20 74.00 -39.27 108 “ T74 79.20 95.40 -27.34 109 “ BB1/11 66.20 72.40 -39.27 110 “ T44 77.60 109.00 -28.81 111 “ 10619 81.60 96.10 -25.14 112 “ T46 73.00 91.50 -33.03 113 “ T49 78.40 97.60 -28.07 114 “ T35 78.00 96.90 -28.44 115 “ T14(1) 86.40 97.40 -20.73 116 “ T45 80.20 106.80 -26.42 117 “ BB1/4 65.00 70.40 -40.37 118 “ T44 79.40 93.50 -27.16 119 “ T43 79.20 92.80 -27.34 120 “ 300 89.80 92.40 -17.61 121 “ 304 95.00 100.30 -12.84 Max 95.00 109.00 -12.84 Min 63.00 70.40 -42.20 Trung bỡnh 76.23 90.15 -30.07
4.2.1.2. Khảo sỏt ƯTL thực về chiều dài và chiều rộng lỏ đũng
Lỏ là bộ phận rất quan trọng, là nơi diễn ra hoạt động quang hợp để tạo hydrat cacbon làm nờn năng suất cõy trồng. Trờn một nhỏnh lỳa thỡ lỏ đũng là lỏ cuối cựng đồng thời cú vị trớ cao nhất do vậy tiếp nhận được nhiều ỏnh sỏng nhất. Từ sau khi trỗ thỡ lỏ đũng hoạt động khụng kộm gỡ lỏ cụng năng, song vỡ lỏ đũng trẻ hơn do đú nú cú vai trũ lớn nhất trong nuụi dưỡng bụng lỳa.
Lỏ đũng cú diện tớch lớn hơn thỡ hoạt động quang hợp diễn ra mạnh hơn. Diện tớch lỏ đũng được quyết định bởi chiều dài và chiều rộng lỏ đũng. Tiến hành khảo sỏt ƯTL của cỏc con lai F1 so với bố tốt nhất của chỳng về chiều dài và chiều rộng lỏ đũng, chỳng tụi thu được kết quả ở bảng 5.
Qua bảng 5 cho thấy:
Về chiều dài lỏ đũng: Cỏc con lai F1 cú chiều dài lỏ đũng dao động trong khoảng 25.70 - 44.20 cm và chiều dài trung bỡnh của cỏc con lai F1 là 32.54 cm. Tổ