Cỏc dũng TGMS: 103S, T1S-96, 64S, 287S, 36S2, Kim 76S, Pải 64S và 25S. Tổ hợp lai TH3- 3 (T1S-96/R3), Việt lai 24 (103S/IR24) và quần thể phõn ly F2
Gồm 21 tổ hợp lai F1 (bảng 2) thu được từ phộp lai giữa dũng mẹ TGMS (103S) với cỏc dũng bố khỏc nhau, quần thể phõn ly F2.
Bảng 2: Danh sỏch cỏc tổ hợp lai F1 Tổ hợp Dũng mẹ Dũng bố Tổ hợp Dũng mẹ Dũng bố 101 103S T69 111 103S 10619 102 “ BB3/10 112 “ T46 103 “ BB4/10 113 “ T49 104 “ T72 114 “ T35 105 “ B3/10 115 “ T14(1) 106 “ 10572 116 “ T45 107 “ BB4/5 117 “ BB1/4 108 “ T74 118 “ T44 109 “ BB1/11 119 “ T43 110 “ T44 120 103S 300 121 “ 304 3.1.2. Thớ nghiệm trong phũng
+ Cặp mồi để phỏt hiện gen tms2 là RM11 theo tỏc giả M.T.Lopez et al (2003) cú trỡnh tự là:
RM11-F: 5’ tctcctcttcccccgatc-3’ RM11-R: 5’ atagcgggcgagcttag-3’
- Húa chất dựng chạy PCR: dNTP, MgCl2, Taq AND polymerase, PCR mastermix, nước cất.
+ Húa chất dựng để chiết tỏch ADN hệ gen: Thành phần dung dịch đệm chiết tỏch Thành phần dung dịch đệm chiết tỏch Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung dịch làm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tỏch Tris- HCl(pH=8) 1M 50mM 0.5ml EDTA(pH=8) 0,5M 0.25mM 0.5ml SDS 10% 1% 1.0ml NaCl 5M 300mM 0.6ml H2O 7.4ml Ngoài ra cũn:
+ Hỗn hợp Phenol: Chlorofom: Isoamylalcohol (25: 24: 1)
+ Ethanol 70% + Đỏ lạnh Dung dịch đệm TE Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung dịch làm việc Hỗn hợp 50ml dung dịch TE làm việc Tris- HCl(pH=8) 1M 10mM 0.5ml EDTA(pH=8) 0.5M 1mM 0.1ml H2O 49.4ml
+ Húa chất dựng cho chạy điện di trờn gel agarose: Agarose 1%, ethidium bromide 10mg/ml, Loading Buffer (Bromophenol blue, Xylene cyanol, Succarose)
- TAE (Tris Base, glacial acetic acid, EDTA) 1X
+ Trang thiết bị mỏy múc trong phũng:
- Mỏy PCR, mỏy chạy điện di, mỏy chụp ảnh điện di, mỏy li tõm, mỏy votex, tủ lạnh, lũ vi súng.
- Cỏc loại ống eppendorf, cỏc loại pipet và đầu tiếp đi kốm.
3.1.3. Thời gian nghiờn cứu
Đề tài được thực hiện từ thỏng 01/2009 đến thỏng 07/2009.
3.1.4. Địa điểm nghiờn cứu
Tại phũng Cụng nghệ sinh học ứng dụng và Khu thớ nghiệm đồng ruộng Khoa Nụng Học - Trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội.
3.2. Nội dung nghiờn cứu
- Nghiờn cứu sử dụng chỉ thị PCR nhằm phỏt hiện gen bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ.
- Nghiờn cứu di truyền gen bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ tms2 ở quần thể phõn ly F2 của TH3-3 (T1S-96/R3), Việt lai 24 (103S/IR24) bằng phương phỏp thống kờ khi bỡnh phương (χ2).
- Khảo sỏt ƯTL thực của cỏc tổ hợp lai F1 so với bố tốt nhất của chỳng.
3.3. Phương phỏp nghiờn cứu
3.3.1. Xỏc định khả năng chứa gen tms2 bằng phương phỏp PCR
- Chiết tỏch ADN tổng số của dũng mẹ TGMS, cỏc tổ hợp phõn ly F2
của TH3-3 (T1S-96/R3), Việt lai 24 (103S/IR24) theo quy trỡnh cải tiến của Khoa Cụng nghệ sinh học Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội.
Cỏc bước tiến hành như sau:
Bước 1: Thu ngắt mẫn lỏ khỏe dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf
cú dung tớch 1.5ml, đỏnh dấu tờn giống rồi bỏ vào đỏ lạnh.
Bước 2: Trong phũng thớ nghiệm cỏc cối sứ đó được hấp khử trựng đặt
trong đỏ lạnh. Cỏc mẫu lỏ được cắt nhỏ 0.5cm rồi bỏ vào cối sứ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 3: Nhỏ 400àl dung dịch chiết xuất ADN vào cối rồi lấy chày
chứng tỏ tế bào lỏ đó vỡ và diệp lục được giải phúng ra.
Bước 4: Cho thờm 400àl dung dịch chiết xuất ADN vào và trộn lẫn và
chuyển 400àl vào ống eppendorf đó được đỏnh dấu.
Bước 5: Cho vào ống eppendorf 700àl hỗn hợp Phenol: Chlorofom:
Isoamylalcohol (25:24:1). Sau đú ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 7 phỳt ở 4oC, rồi hỳt phần dung dịch phớa trờn sang ống eppendorf mới đó được đỏnh dấu tương ứng.
Bước 6: Cho 600àl, hỗn hợp Chlorofom: Isoamylalcohol (24 : 1) lắc đều
sau đú ly tõm 7phỳt với tốc độ 13000 vũng/phỳt. Sau đú hỳt phần dung dịch ở trờn vào ống eppendorf mới đó đỏnh dấu tương ứng.
Bước 7: Cho 800àl Ethanol (96%) (hoặc 600àl Isopropanol), trộn đều sau
đú ly tõm 7 phỳt với tốc độ 13000 vũng/phỳt. Sau đú đỗ phần dung dịch phớa trờn giữ lại phần kết tủa dưới đỏy ống nghiệm.
Bước 8: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khụ tự nhiờn ở nhiệt độ
phũng bằng cỏch ỳp ngược ống nghiệm lờn giấy thấm.
Bước 9: Hũa tan kết tủa bằng 50àl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ
-20oC.
- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi RM11 cho gen tms2.
Thành phần cho phản ứng PCR Stt Thành phần Nồng độ dung dịch làm việc Thể tớch (àl) 1 Nước cất vụ trựng 12.5 2 PCR buffer 1X 2.0 3 dNTPs 0.2mM 0.4 4 Primer- F 10pmol 1.0 5 Primer- R 10pmol 1.0 6 MgCl2 2.5mM 1.0
7 ADN Taqpolimerase 0.25 unit/àl 0.1
8 ADN nguyờn bản 50 ng/àl 1.0
Chu trỡnh nhiệt PCR cho cặp mồi tms2
Step Nhiệt độ (0C) Thời gian (phỳt)
2 94 1
3 58 1
4 72 2
Chạy với 35 chu kỳ từ bước 2.
Kết thỳc 72 4
Bảo quản 4 Tựy theo
- Chạy điện di phỏt hiện sản phẩm PCR trờn gel agarose 1%
Chuẩn bị gel: Cõn 100g agar cho vào 100ml dung dịch TAE 1X đun
đến khi tạo agarose trong suốt.
Lấy dung dịch đổ vào khay để tạo khay điện di. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chạy điện di: Lấy 10àl ADN là sản phẩm PCR trộn lẫn với 2àl loading
Buffer 10X rồi đổ vào giếng điện di.
Gel được đặt trong mỏy điện di với dung dịch điện di là TAE 1X, dưới hiệu điện thế 65V, cường độ dũng điện mA, trong thời gian khoảng 20 – 30 phỳt.
Chụp ảnh điện di: Bản gel sau khi chạy điện di đem đi nhuộm trong
Ethidium Bromide trong 10 phỳt. Sau đú bản gel được đưa vào thiết bị chiếu tia UV và chụp ảnh điện di.
3.3.2. Nghiờn cứu chọn lọc TGMS mớiChọn lọc theo sơ đồ:Chọn lọc theo sơ đồ: Chọn lọc theo sơ đồ:
Từ F2 dựng chỉ thị phõn tử DNA chọn dạng tms2tms2 trồng và chọn lọc cỏc đặc tớnh sinh học tốt để phục vụ cho cụng tỏc chọn tạo giống lỳa lai hai dũng.
3.3.3. Nghiờn cứu khả năng bất hữu dục của cỏc cỏ thể F2 của tổ hợp TH3-3 (T1S-96/R3) và Việt lai 24 (103S/IR24)TH3-3 (T1S-96/R3) và Việt lai 24 (103S/IR24) TH3-3 (T1S-96/R3) và Việt lai 24 (103S/IR24)
Bằng phương phỏp soi hạt phấn: Hạt phấn được lấy ở những bụng bắt đầu tung phấn, trờn cựng một bụng lấy ở ba điểm khỏc nhau (đầu bụng, cuối bụng và giữa bụng). Sau đú nhuộm bằng dung dịch I-KI 1% và quan sỏt dưới kớnh hiển vi. Nếu hạt phấn đú trũn đen thỡ hạt phấn đú hữu dục. Quan sỏt và đếm cú hơn 80% hạt phấn hữu dục thỡ cõy đú hữu dục, cũn nếu hơn 80% hạt phấn bất dục thỡ cõy đú bất dục.
3.3.4. Nghiờn cứu ƯTL thực của cỏc tổ hợp F1 với cỏc dũng bố khỏc nhau so với bố tốt nhất của chỳngso với bố tốt nhất của chỳng so với bố tốt nhất của chỳng
Cỏc chỉ tiờu theo dừi:
+Lượng cõy theo dừi: Mỗi tổ hợp theo dừi 10 cõy liờn tiếp, cỏch bờ ớt nhất ba khúm. Đo đếm cỏc chỉ tiờu liờn hoàn của từng cõy.
+Nghiờn cứu một số đặc điểm nụng sinh học.
+Thời gian từ cấy đến chớn hoàn toàn: khi 85% số hạt trờn bụng đó chớn hoàn toàn. ♀ TGMS (tms2tms2) x ♂ (Tms2Tms2) F1 (Tms2tms2) (Tms2Tms2)(Tự thụ, chọn cõy cú kiểu gen Tms2Tms2 bằng PCR) F2(Tms2Tms2, Tms2tms2, tms2tms2
-Số nhỏnh tối đa/khúm.
-Chiều dài lỏ đũng (cm): đo từ gối lỏ đến mỳt đầu lỏ, đo vào giai đoạn chớn sỏp.
-Chiều rộng lỏ đũng: đo ở chỗ rộng nhất.
-Chiều cao cõy cuối cựng (cm): đo từ mặt đất đến mỳt đầu bụng dài nhất khụng kể rõu.
-Tổng thời gian sinh trưởng.
-Số nhỏnh hữu hiệu/khúm: đếm toàn bộ số nhỏnh trỗ thành bụng.
-Số bụng hữu hiệu/khúm: đếm toàn bộ số bụng cú từ 10 hạt chắc trở lờn.
-Tổng số hạt/bụng.
-Tổng số hạt chắc/bụng.
-Khối lượng nghỡn hạt.
-Năng suất lý thuyết được tớnh theo cụng thức. NSLT = A x B x C x mật độ/đơn vị diện tớch (g). Trong đú: A: số bụng hữu hiệu/khúm.
B: số hạt chắc/bụng. C: khối lượng 1000 hạt. + Phương phỏp tớnh ƯTL. Tớnh ƯTL thực: HBP% =
Trong đú BP (best parents) là bố hoặc mẹ tốt nhất
ƯTL thực là biểu hiện sự hơn hẳn ở một tớnh trạng nào đú của con lai F1 so với giỏ trị đú của bố hoặc mẹ tốt nhất (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
F1- MP
Số liệu thu được được sử lý theo thống kờ trờn phần mền Microsoft Office Excel 2003. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.4. Bố trớ thớ nghiệm và cỏc biện phỏp kỹ thuật
* Bố trớ thớ nghiệm:
- Thớ nghiệm được bố trớ theo phương phỏp khảo sỏt tập toàn, cỏc con lai F1 trồng cạnh bố tương ứng.
- ễ thớ nghiệm được bố trớ theo hỡnh chữ nhật mỗi ụ là: 5m2.
* Cỏc biện phỏp kỹ thuật:
- Làm đất cày bừa như bỡnh thường. - Thời vụ: Vụ chim xuõn năm 2009. - Ngày gieo mạ: 08/01/2009.
- Ngày cấy: 10/02/2009.
- Làm cỏ, tưới nước, tiờu nước, phũng trừ sõu bệnh. - Cấy 1 rảnh/khúm, cõy x cõy 11cm, hàng x hàng 20cm. - Mật độ cấy 45 khúm/m2
- Lượng phõn bún cho một ha.
+ Lượng phõn bún: - Phõn đạm: 120kg. - Phõn lõn: 90kg. - Phõn kali: 60kg. + Kỹ thuật bún phõn:
- Bún lút: 100% phõn lõn + 30% phõn đạm, bún sau khi bừa.
- Bún thỳc lần 1: 50% phõn đạm + 40% phõn kali, bún vào thời kỳ bắt đầu đẻ nhỏnh.
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả tiến hành phản ứng PCR xỏc định gen tms2
4.1.1. Kết quả kiểm tra độ nguyờn vẹn và tinh sạch của ADN tổng số
ADN tổng số được chiết tỏch theo cải tiến của khoa Cụng nghệ sinh học. Sau đú, chỳng tụi tiến hành kiểm tra độ nguyờn vẹn và tinh sạch của ADN tổng số theo phương phỏp điện di trờn gel agarose 1%. Kết quả cho thấy tất cả cỏc băng ADN đều gọn và rừ nột (hỡnh 1). Điều đú đảm bảo độ nguyờn vẹn và tinh sạch của ADN cú thể tiến hành phản ứng PCR để xỏc định sự cú mặt của gen tms2.
Thứ tự cỏc giếng 1.T1S-96, 2. IR24, 3. 103S, 4. 64S, 5. 25S, 6. Pải 64S, 7. 287S, 8. Kim 76S, 9.TH3-3- 12, 10. Việt lai 24- 14
Hỡnh 1: Ảnh diện di kiểm tra độ nguyờn vẹn cà tinh sạch của ADN 4.1.2. Xỏc định gen tms2 trờn cỏc dũng TGMS
Hiện nay cú rất nhiều dũng TGMS tuy nhiờn chỳng tụi chưa biết chỳng chứa gen tms nào. Bởi vậy, để phục vụ cụng tỏc chọn tạo giống lỳa lai hai dũng chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu cỏc dũng TGMS sau: 103S, 64S, T1S96, 287S, Kim 76S, 36S2, Pải 64S và 25S. Để biết cỏc dũng TGMS này chứa gen
tms nào chỳng tụi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi sử dụng là RM11, sau
đú tiến hành điện di với thứ tự cỏc giếng là: 1. DNA leader, 2. 103S, 3. IRBB21, 4. T1S-96, 5. R3, 6. 36S2, 7. Pải 64S, 8. Kim 76S, 9. 25S, 10. 64S, 11. 287S và kết quả điện di thu được ở hỡnh 2. Qua hỡnh 2, chỳng tụi thấy cỏc dũng 103S, 64S, T1S-96, Pải 64S, đều chứa gen bất dục mẫn cảm với nhiệt độ tms2 với kớch thước khoảng 280bp, cũn cỏc dũng cũn lại khụng chứa gen tms2.
1. DNA leader, 2. 103S, 3. IR24, 4.T1S-96, 5.R3, 6.36S2, 7.Pải 64S, 8. Kim 76S, 9. 25S, 10. 64S, 11. 287S.
Hỡnh 2 Ảnh điện di phỏt hiện gen tms2 ở cỏc dũng TGMS với mồi RM11. 4.1.3. Phỏt hiện cỏ thể chứa gen tms2 ở quần thể phõn ly F2 của tổ hợp lai TH3-3 (T1S-96/R3) và Việt lai 24 (103S/IR24)
Qua kết quả thu ở trờn 4 dũng 103S, 64S, T1S-96, Pải 64S đều chứa gen tms2, nờn chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu di truyền của gen tms2 của cỏc
tổ hợp lai F1 của TH3-3 (T1S-96/R3), Việt lai 24 (103S/IR24) và quần thể phõn ly F2 của chỳng.
Theo kết quả chạy PCR cho quần thể phõn ly F2 của tổ hợp TH3-3 (T1S-96/R3). Điều tra 123 cỏ thể trong quần thể phõn ly F2 chỳng tụi thấy rằng: 31 cỏ thể thuộc dạng Tms2Tms2 (đồng hợp tử trội), 64 cỏ thể thuộc dạng
300 bp 200 bp 500 bp
Tms2tms2 (dị hợp tử) và 28 cỏ thể thuộc dạng tms2tms2 (đồng hợp tử lặn).
Hỡnh 3: Điện di sản phẩm PCR với mồi RM11trờn quần thể phõn ly F2 tổ hợp lai TH3-3 (T1S-96/R3)
Theo kết quả điện di thu được ở hỡnh 3 chỳng tụi thấy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ở giếng 1: dũng bố R3 chứa gen đồng hợp tử trội (Tms2Tms2). - Ở giếng 2: dũng mẹ T1S-96 chứa gen đồng hợp tử lặn (tms2tms2). - Ở giếng 3: con lai F1 TH3-3 chứa gen dị hợp tử (Tms2tms2).
Cỏc giếng cũn lại chứa cỏc cõy của quần thể phõn ly F2 thỡ cú 3 kiểu gen khỏc nhau:
- Ở giếng 9, 11: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen đồng hợp tử lặn tms2tms2. - Ở giếng 5, 6, 10: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen dị hợp tử Tms2tms2. - Ở giếng 4, 7, 8: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen đồng hợp tử trội
Tms2Tms2.
Tương tự với quần thể phõn ly F2 của con lai Việt lai 24 (103S/IR24) chỳng tụi tiến hành phản ứng PCR điều tra 150 cỏ thể F2 và kết quả thu được là 38 cỏ thể thuộc dạng Tms2Tms2, 79 cỏ thể thuộc dạng Tms2tms2 và 33 cỏ thể thuộc dạng tms2tms2.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1. Bố R3, 2. Mẹ T1S-96, 3. F1 (TH3-3), 4.TH3-3 – 12, 5. TH3-3 – 18, 6. TH3-3 – 27, 7. TH3-3 – 63, 8. TH3-3 – 81, 9. TH3-3 – 99, 10. TH3-3- 45, 11.TH3-3- 72
Hỡnh 4: Điện di sản phẩm PCR với mồi RM11 trờn quần thể phõn ly F2 tổ hợp lai Việt lai 24 (103S/IR24)
Theo kết quả điện di thu được ở hỡnh 4 chỳng tụi thấy:
- Ở giếng 1: dũng mẹ 103S chứa gen đồng hợp tử lặn (tms2tms2). - Ở giếng 2: dũng bố IR24 chứa gen đồng hợp tử trội (Tms2Tms2). - Ở giếng 3: con lai F1 Việt lai 24 chứa gen dị hợp tử (Tms2tms2).
Cỏc giếng cũn lại chứa cỏc cõy của quần thể phõn ly F2 thỡ cú 3 kiểu gen khỏc nhau:
- Ở giếng 5, 9, 10, 15: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen đồng hợp tử lặn
tms2tms2.
- Ở giếng 4, 6, 7, 8, 11, 12, 13: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen dị hợp tử
Tms2tms2.
- Ở giếng 14, 16, 17: là cỏc cõy F2 chứa kiểu gen đồng hợp tử trội
Tms2Tms2.
Để kiểm tra độ chớnh xỏc của kỹ thuật PCR chọn lọc cỏc kiểu gen TGMS (tms2) chỳng tụi đỏnh dấu những cỏ thể chọn lọc bằng PCR thụng qua chỉ thị RM11, sau đú soi hạt phấn những cỏ thể đó chọn. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.
1. Mẹ 103S, 2. Bố IR24, 3. F1(Việt lai 24), 4.Việt lai 24- 54, 5.Việt lai 24 – 18, 6.Việt lai 24- 72, 7.Việt lai 24- 81, 8. Việt lai 24- 45, 9.Việt lai 24- 27,
10. Việt lai 24- 10, 11. Việt lai 14- 125, 12. Việt lai 24- 63, 13. Việt lai 24- 44, 14. Việt lai 24- 21, 15. Việt lai 24 – 90, 16. Việt lai 24- 67, 17. Việt lai 24- 87
Bảng 3: Kết quả soi hạt phấn của quần thể phõn ly F2 trờn tổ hợp TH3-3 (T1S-96/R3 ), Việt lai 24 (103S/IR24)
Tổ hợp Kiểu gen
Số lượng cỏ thể trong quần thể
phõn ly F2 Độ chớnh xỏc (%) Số lượng cỏ thể Hữu dục Bất dục TH3-3 (T1S-96/R3) Tms2Tms2 31 30 1 96.77 Tms2tms2 64 62 2 96.87 tms2tms2 28 1 27 96.42 Việt lai 24 (103S/IR24) Tms2Tms2 38 37 1 97.36 Tms2tms2 79 76 1 96.20 tms2tms2 33 1 32 96.96 Hạt phấn bất dục