- Chiết tỏch ADN tổng số của dũng mẹ TGMS, cỏc tổ hợp phõn ly F2
của TH3-3 (T1S-96/R3), Việt lai 24 (103S/IR24) theo quy trỡnh cải tiến của Khoa Cụng nghệ sinh học Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội.
Cỏc bước tiến hành như sau:
Bước 1: Thu ngắt mẫn lỏ khỏe dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf
cú dung tớch 1.5ml, đỏnh dấu tờn giống rồi bỏ vào đỏ lạnh.
Bước 2: Trong phũng thớ nghiệm cỏc cối sứ đó được hấp khử trựng đặt
trong đỏ lạnh. Cỏc mẫu lỏ được cắt nhỏ 0.5cm rồi bỏ vào cối sứ.
Bước 3: Nhỏ 400àl dung dịch chiết xuất ADN vào cối rồi lấy chày
chứng tỏ tế bào lỏ đó vỡ và diệp lục được giải phúng ra.
Bước 4: Cho thờm 400àl dung dịch chiết xuất ADN vào và trộn lẫn và
chuyển 400àl vào ống eppendorf đó được đỏnh dấu.
Bước 5: Cho vào ống eppendorf 700àl hỗn hợp Phenol: Chlorofom:
Isoamylalcohol (25:24:1). Sau đú ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 7 phỳt ở 4oC, rồi hỳt phần dung dịch phớa trờn sang ống eppendorf mới đó được đỏnh dấu tương ứng.
Bước 6: Cho 600àl, hỗn hợp Chlorofom: Isoamylalcohol (24 : 1) lắc đều
sau đú ly tõm 7phỳt với tốc độ 13000 vũng/phỳt. Sau đú hỳt phần dung dịch ở trờn vào ống eppendorf mới đó đỏnh dấu tương ứng.
Bước 7: Cho 800àl Ethanol (96%) (hoặc 600àl Isopropanol), trộn đều sau
đú ly tõm 7 phỳt với tốc độ 13000 vũng/phỳt. Sau đú đỗ phần dung dịch phớa trờn giữ lại phần kết tủa dưới đỏy ống nghiệm.
Bước 8: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khụ tự nhiờn ở nhiệt độ
phũng bằng cỏch ỳp ngược ống nghiệm lờn giấy thấm.
Bước 9: Hũa tan kết tủa bằng 50àl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ
-20oC.
- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi RM11 cho gen tms2.
Thành phần cho phản ứng PCR Stt Thành phần Nồng độ dung dịch làm việc Thể tớch (àl) 1 Nước cất vụ trựng 12.5 2 PCR buffer 1X 2.0 3 dNTPs 0.2mM 0.4 4 Primer- F 10pmol 1.0 5 Primer- R 10pmol 1.0 6 MgCl2 2.5mM 1.0
7 ADN Taqpolimerase 0.25 unit/àl 0.1
8 ADN nguyờn bản 50 ng/àl 1.0
Chu trỡnh nhiệt PCR cho cặp mồi tms2
Step Nhiệt độ (0C) Thời gian (phỳt)
2 94 1
3 58 1
4 72 2
Chạy với 35 chu kỳ từ bước 2.
Kết thỳc 72 4
Bảo quản 4 Tựy theo
- Chạy điện di phỏt hiện sản phẩm PCR trờn gel agarose 1%
Chuẩn bị gel: Cõn 100g agar cho vào 100ml dung dịch TAE 1X đun
đến khi tạo agarose trong suốt.
Lấy dung dịch đổ vào khay để tạo khay điện di.
Chạy điện di: Lấy 10àl ADN là sản phẩm PCR trộn lẫn với 2àl loading
Buffer 10X rồi đổ vào giếng điện di.
Gel được đặt trong mỏy điện di với dung dịch điện di là TAE 1X, dưới hiệu điện thế 65V, cường độ dũng điện mA, trong thời gian khoảng 20 – 30 phỳt.
Chụp ảnh điện di: Bản gel sau khi chạy điện di đem đi nhuộm trong
Ethidium Bromide trong 10 phỳt. Sau đú bản gel được đưa vào thiết bị chiếu tia UV và chụp ảnh điện di.