Để thực hiện thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus LYSV lên cây thuốc lá, chúng tôi đã sử dụng 2 giống thuốc lá là Nicotiana benthamiana và Nicotiana tabacum var. Xanthi. Các cây thuốc lá được trồng trong chậu tại nhà lưới, sau khi cây được 4-5 lá thì chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo. Dịch virus được nghiền bằng chày cối sứ trên đệm phosphate pH 7.0. Với mỗi lần lây chúng tôi tiến hành lây trên 4 cây với mỗi loại thuốc lá, lây song để cách ly ra và theo dõi triệu chứng.
Sau một thời gian theo dõi, kết quả được chúng tôi tổng hợp vào bảng 4.8.
STT Mẫu lây Số câylây
Triệu chứng
Nicotinana benthamiana Nicotiana tabacumvar. Xanthi
1 CB 4 Không Không 2 GL 4 Không Không 3 HN 4 Không Không 4 HY 4 Không Không 5 HD 4 Không Không 6 LS 4 Không Không 7 NB 4 Không Không 8 NĐ 4 Không Không 9 PT 4 Không Không 10 TB 4 Không Không 11 TT 4 Không Không 12 TQ 4 Không Không
Từ bảng kết quả 4.8 chúng tôi nhận thấy:
Việc lây nhiễm nhân tạo virus LYSV lên cây thuốc lá không biểu hiện triệu chứng bệnh, điều này cho thấy virus trên hành tỏi không biểu hiện triệu chứng bệnh lên cây thuốc lá. Điều này, cho thấy các cây thuốc lá không phải là cây kí chủ mẫn cảm đối với virus LYSV trên tỏi.
(A) (B) Hình 4.10 Cây thuốc lá được lây nhiễm nhân tạo A. Giống thuốc lá Nicotinana benthamiana
B. Giống thuốc lá Nicotiana tabacum var. Xanthi 4.3.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo virus LYSV lên cây hành
Các virus trên cây tỏi cũng đã được xác định trên cây hành. Để thực hiện thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus LYSV lên cây hành, chúng tôi đã sử dụng 2 giống hành là hành hương xanh và hành lá gốc tím. Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá tính gây bệnh, đặc biệt là triệu chứng biểu hiện của virus trên cây hành làm cơ sở cho chẩn đoán đồng ruộng.
Các cây hành được trồng trong chậu, sau khi cây được nảy mầm được 20 – 30 ngày, chiều cao cây khoảng 6 – 8 cm thì chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo. Dịch virus và đệm lây được chuẩn bị giống với như khi lây nhiễm trên cây thuốc lá.
Bảng 4.9 Kết quả lây nhiễm virus LYSV lên cây hành lá gốc tím STT Mẫu lây Số câylây Số cây bịbệnh Tỷ lệ bệnh(%) Triệu chứng
1 CB 5 4 80 Sọc vàng nhỏ nhiều, lá quăn 2 GL 5 5 100 Sọc vàng nhỏ nhiều, lá cong 3 NS 5 5 100 Sọc vàng nhỏ nhiều, 4 HY 5 3 60 Sọc vàng thẳng nhỏ nhiều, đứt đoạn 5 LS 5 5 100 Sọc vàng thẳng nhỏ nhiều 6 NB 5 3 60 Sọc vàng nhỏ nhiều, lá cong 7 NĐ 5 2 40 Sọc vàng nhỏ nhiều 8 PT 5 1 20 Sọc vàng nhỏ 9 TB 5 5 100 Sọc vàng nhỏ nhiều, lá quăn 10 TQ 5 3 60 Sọc vàng nhỏ nhiều
Bảng 4.10 Kết quả lây nhiễm virus LYSV lên cây hành hương xanh. STT Mẫu lây Số câylây Số cây bịbệnh Tỷ lệ bệnh(%) Triệu chứng
1 CB 5 3 60 Sọc vàng nhỏ nhiều, lá cong,
chuyển vàng
2 GL 5 5 100 Sọc vàng nhỏ nhiều
3 NS 5 5 100 Sọc vàng nhỏ nhiều
4 HY 5 3 60 Sọc vàng nhỏ nhiều, quăn lá, chuyển vàng
5 LS 5 3 60 Sọc vàng nhỏ nhiều 6 NB 5 5 100 Sọc vàng nhỏ nhiều 7 NĐ 5 2 40 Sọc vàng nhỏ nhiều 8 PT 5 4 80 Sọc vàng nhỏ nhiều, sọc đứt đoạn 9 TB 5 5 100 Sọc vàng nhỏ nhiều 10 TQ 5 2 40 Sọc vàng nhỏ
Từ bảng kết quả 4.9 và 4.10 chúng tôi thấy:
Cả hai giống hành lá gốc tím và hành hương xanh đều biểu hiện triệu chứng bệnh với tất cả các mẫu virus lây và biểu hiện triệu chứng bệnh với tỷ lệ bệnh cao.
Trên cây hành lá gốc tím khi lây nhiễm nhân tạo với các mẫu virus ĐX, NS, LS, TB lên cây biểu hiện triệu chứng với tỷ lệ bệnh là 100%. Các mẫu CB,
HY, NB, TQ khi lây nhiễm lên cây hành lá gốc tím cũng cho tỷ lệ bệnh rất cao 60 - 80%. Triệu chứng điển hình trên cây hành lá gốc tím là các vết sọc màu vàng nhỏ nhiều, một số cây bị nặng lá bị cong, quăn lại, giống với triệu chứng virus trên cây tỏi.
Trên cây hành hương xanh khi lây nhiễm các mẫu virus ĐX, NS, NB, TB lên cây cho tỷ bệnh là 100%. Các mẫu CB, HY, LS, PT khi lây nhiễm lên cây cũng cho tỷ lệ bệnh khá cao 60-80%. Triệu chứng điển hình xuất hiện là những sọc vàng nhỏ, giống với triệu chứng của virus trên cây tỏi. Một số cây bị nặng lá quăn lại, chuyển vàng.
Hình 4.11 Triệu chứng nhiễm virus trên cây hành lá gốc tím
Hình 4.12 Triệu chứng nhiễm virus trên cây hành hương xanh
4.3.3. Kết quả lây nhiễm nhân tạo lên cây chỉ thị rau muối
Để thực hiện thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo virus LYSV lên cây chỉ thị rau muối, chúng tôi đã sử dụng 2 loài rau muối là Chenopodium amaranticolor
và Chenopodium quinoa.Đây là loại cây chỉ thị rất mẫm cảm với các virus được sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu virus thực vật. Các cây rau muối được trồng
trong chậu, khi cây được 4-5 lá thật và chiều cao cây khoảng 8-10 cm thì chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo. Kết quả được trình bày ở bảng 4.11.
Bảng 4.11 Kết quả lây nhiễm virus LYSV lên cây chỉ thị rau muối
STT Mẫulây Chenopodium amaranticolorTriệu chứng Chenopodium quinoa
1 TB Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to, sau nhiều vết vàng nhỏ
Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng 2 HD Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,
sau nhiều vết vàng nhỏ
Đốm hoại tử màu trắng vàng lớn, vết loang lổ màu vàng 3 NB Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,
sau nhiều vết vàng nhỏ
Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng 4 GL Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,
sau nhiều vết vàng nhỏ
Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng 5 NĐ Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,sau nhiều vết vàng nhỏ Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng 6 TQ Đôm hoại tử màu trắng to Đốmhoại tử màu trắng xám lớn 7 HT Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,sau nhiều vết vàng nhỏ Đốm hoại tử màu trắng
8 NS Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,sau nhiều vết vàng nhỏ Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng 9 HY Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,sau nhiều vết vàng nhỏ Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng 10 PT Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,sau mnhiều vết vàng nhỏ Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng 11 CB Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to,sau nhiều vết vàng nhỏ Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng 12 LS Lúc đầu đốm hoại tử màu trắng to, sau nhiều vết vàng nhỏ Đốm hoại tử màu trắng xám lớn, vết loang lổ màu vàng
Qua bảng kết quả 4.11 chúng tôi nhận thấy:
Tất cả 12 mẫu virus lây lên hai cây chỉ thị rau muối đều biểu hiện triệu chứng bệnh. Trên cây rau muối Chenopodium amaranticolor cótriệu chứng sau 1, 2 tuần lây nhiễm là các đốm hoại tử màu trắng to, sau 3, 4 tuần có triệu chứng chứng nhiều chấm vàng nhỏ dày trên mặt lá. Trên cây rau muối Chenopedium quinoa triệu chứng sau 1, 2 tuần lây nhiễm là các đốm hoại tử màu trắng xám lớn, sau 3, 4 tuần lây nhiễm là các vết loang lổ màu vàng trên lá, về sau lá chuyển dần sang màu vàng.
Hình 4.13 (a) Triệu chứng nhiễm virus trên cây rau muối (Chenopodium
quinoa) sau lây nhiễm 1,2 tuần
Hình 4.13 (b) Triệu chứng nhiễm virus trên cây rau muối (Chenopodium
quinoa) sau lây nhiễm 3,4 tuần
Hình 4.13 (c) Triệu chứng nhiễm virus trên cây rau muối (Chenopodium amaranticolor) sau lây nhiễm 1,2 tuần
Hình 4.13 (d) Triệu chứng nhiễm virus trên cây rau muối (Chenopodium amaranticolor) sau lây nhiễm 3,4 tuần
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Sau 6 tháng hiện đề tài, từ kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã điều tra và thu thập được 18 mẫu bệnh virus trên cây tỏi ở 9 địa phương thuộc 9 tỉnh miền Bắc Việt nam. Tất cả các điểm điều tra đều bị nhiễm bệnh
virus với tỷ lệ cao, nhiều ruộng bị nhiễm bệnh virus 100%. Qua điều tra, triệu chứng nhiễm virus trên lá cây tỏi chủ yếu là các vết sọc màu vàng, khi bị nặng làm cho lá quăn lại.
2. Đã điều tra diễn biến bệnh virus trên cây tỏi tại 2 địa phương: Đặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội và Nam Sách – Hải Dương ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây tỏi. Qua điều tra, kết quả cho thấy bệnh sọc vàng xuất hiện trên đồng ruộng từ rất sớm (22 ngày sau trồng). Tỷ lệ nhiễm bệnh lên đến 30% ở Đặng Xá – Gia lâm – Hà Nội và 10% ở Nam Sách – Hải Dương. Triệu chứng ban đầu là các sọc vàng mờ, về sau vết sọc rõ hơn và xuất hiện nhiều lá bị quăn lại.
3. Đã thu thập mẫu củ tỏi giống ở 6 tỉnh miền Bắc và thực hiện thí nghiệm đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh qua củ. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đều truyền bệnh virus qua củ với tỷ lệ bệnh lên đến 100%. Triệu chứng quan sát được chủ yếu là các vết sọc màu vàng giống như triệu chứng ngoài đồng ruộng.
4. Đã kiểm tra PCR trên một số mẫu lá tỏi bị bệnh thu được ở một số tỉnh miền Bắc. Kết quả cho thấy virus gây triệu chứng sọc vàng trên cây tỏi là Leek yellow stripe virus (LYSV).
5. Đã thực hiện lây nhiễm nhân tạo virus LYSV lên cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana và Nicotiana tabacum var. Xanthi). Kết quả cho thấy cả 2 giống thuốc lá này đều không bị nhiễm bệnh. Những nghiên cứu trước đây cũng cho kết quả tương tự.
6. Đã thực hiện lây nhiễm nhân tạo virus LYSV lên cây hành (hành hương xanh và hành lá gốc tím). Kết quả cho thấy 2 giống hành đều biểu hiện triệu chứng virus LYSV với tỷ lệ nhiễm bệnh cao từ 20 - 100%, các triệu chứng quan sát được chủ yếu là các sọc màu vàng nhỏ, giống với triệu chứng nhiễm virus trên cây tỏi.
7. Đã thực hiện lây nhiễm nhân tạo virus LYSV lên cây chỉ thị rau muối (Chenopodium amaranticolor và Chenopodium quinoa). Kết quả cho thấy 2 loại rau muối đều biểu hiện triệu chứng ở các mẫu lây. Triệu chứng quan sát
được trên giống Chenopodium amaranticolor sau 1, 2 tuần lây nhiễm là đốm họai tử tròn màu trắng vàng, sau 3, 4 tuần là các đốm màu vàng tròn nhỏ dần lan rộng khắp mặt lá. Triệu chứng trên cây rau muối Chenopodium quinoa
sau 1, 2 tuần lây nhiễm là các đốm hoại tử màu trắng to, sau 3, 4 tuần là các vết màu vàng loang lổ, lan rộng khắp mặt lá.
5.2. Đề nghị
Do điều hiện nghiên cứu còn hạn chế và thời gian có hạn nên chúng tôi chưa có điều kiện đi sâu nghiên cứu và đề nghị tiếp tục nghiên cứu một số vấn đề sau:
1. Tiếp tục lây bệnh nhân tạo trên một số cây họ hành tỏi khác.
2. Tiếp tục kiểm tra PCR trên các mẫu tỏi bị bệnh thu được ngoài đồng ruộng, các mẫu truyền qua củ ngoài nhà lưới và các cây đã được lây bệnh nhân tạo.
3. Xác định chính xác các virus lây nhiễm trên cây tỏi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu trong nước
1. Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. (2009). Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
2. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005) Giáo trình “Công nghệ sinh học nông nghiệp”. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Hà Viết Cường (2010), Bài giảng virus thực vật, phytoplasma và viroid.
5. Phương, N. T. T. and N. T. L. Anh (2011). "Nghiên cứu làm sạch virus cho cây tỏi ta (Allium Sativum L.) bằng nuôi cấy."
6. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (2001). Giáo trình bệnh cây nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
II. Tài liệu nước ngoài
7. A.S. Abdel Wahab, S. Elnagar and M.A.K. El-Sheikh (2009). Incidence of Aphid - borne Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV) in Alliaceae Crops and Asociated Weeds in Egypt, pp 21-23.
8. Bos, L., et al. (1978) "Leek yellow stripe virus and its relationships to onion yellow dwarf virus; characterization, ecology and possible control." Netherlands Journal of Plant Pathology 84.5, pp 185-204. 9. Bos, L. (1976). Onion yellow dwarf virus. CMI/AAB Descr. Pl.
Viruses No. 158, pp 4.
10. Bos, L. (1983). Viruses and virus diseases of Allium species. Acta Hortic. 127, pp 11-29.
11. Bos, L. (1982, September). Viruses and virus diseases of Allium species. In IV Conference on recent Advances in Vegetable Virus Research 127, pp11-30.
12.Diekmann, Marlene, ed. (1997). “Allium spp.” No. 18. Bioversity International, pp 23.
13. Dijk, P. (1993). "Survey and characterization of potyviruses and their strains of Allium species." Netherlands Journal of Plant Pathology 99 (2), pp 1-48.
14. El-Wahab, AS Abd. (2009). "Aphid-Transmission Efficiency of Two Main Viruses on Garlic in Egypt, Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV- G) and Leek Yellow Stripe Virus (LYSV-G).", pp 40-44.
15. Etoh, T., Simon, P. W., Rabinowitch, H. D., & Currah, L. (2002). Diversity, fertility and seed production of garlic. Allium crop science: recent advances, pp 101-117.
16. Ha, C., Revill, P., Harding, R. M., Vu, M., & Dale, J. L. (2008). Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam. Archives of virology, 153, pp 45-60.
17. Ibrahim, K. M., Nichols, R. A., & Hewitt, G. M. (1996). Spatial patterns of genetic variation generated by different forms of dispersal. Heredity, 77, pp 282-291.
18. Lot, H., Chovelon, V., Souche, S., & Delecolle, B. (1998). Effects of onion yellow dwarf and leek yellow stripe viruses on symptomatology and yield loss of three French garlic cultivars. Plant Disease, 82(12), pp 1381-1385.
19. Lunello, P., et al. (2002). "An Argentinean isolate of Leek yellow stripe virus from leek can be transmitted to garlic." Journal of Plant Pathology 84.1, pp 11-17.
20. Lunello, Pablo, et al. (2004) "Ultra-sensitive detection of two garlic potyviruses using a real-time fluorescent RT-PCR assay." Journal of virological methods 118.1, pp 15-21.
21. Schwartz, H. F., & Mohan, S. K. (1995). Compendium of onion and garlic diseases. APS.PRESS. The American Phytopathological Society. pp 52.
22. Schwartz, Howard F., and S. Krishna Mohan. (2007) "Compendium of onion and garlic diseases and pests." Compendium of onion and garlic diseases and pests Ed. pp 2.
23. Shukla, D. D., Ward, C. W., Brunt, A. A., & Berger, P. H. (1998). Potyviridae family. AAB/CMI Descriptions of plant viruses, pp 366. 24. S. Elnagar, M. A. K. El – Sheikh and A. S. Abdel Wahab (2009).
Effects of natural infection with onion yellow dwarf (OYDV) on yield of onion and garlic crops in egypt, pp 34-39.
25. Takaichi, M., Yamamoto, M., Nagakubo, T., & Oeda, K. (1998). Four garlic viruses identified by reverse transcription-polymerase chain reaction and their regional distribution in northern Japan. Plant Disease, 82(6), pp 694-698.
26. Takaki, F., Sano, T., Yamashita, K., Fujita, T., Ueda, K., & Kato, T. (2005). Complete nucleotide sequences of attenuated and severe isolates of Leek yellow stripe virus from garlic in northern Japan: Identification of three distinct virus types in garlic and leek world- wide. Archives of virology, 150(6), pp 1135-1149.
27. Tsuneyoshi, T., et al. (1998) "Nucleotide sequence analysis of virus isolates indicates the presence of three potyvirus species in Allium plants." Archives of virology 143.1, pp 97-113.
28. Van Dijk, P. (1993). Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses. Netherlands Journal of Plant Pathology, 99(5-6), pp 233-257.
29. Van der Vlugt, R. A. A., et al. (1999) "Further evidence that shallot yellow stripe virus (SYSV) is a distinct potyvirus and reidentification of Welsh onion yellow stripe virus as a SYSV strain." Phytopathology 89.2, pp 148-155.
30.Vilma C., et al. (2003) "Yield losses associated with virus-infected garlic plants during five successive years." Plant disease 87.12 , pp 1411-1415.