Chẩn đoán virus gây bệnh trên tỏi bằng kỹ thuật PCR: PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20 trong sinh học phân tử. PCR là một
kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu CNSH. Có vô số tài liệu tiếng Việt và tiếng Anh về kỹ thuật PCR. Dưới đây là tóm tắt kỹ thuật. Tùy thuộc khuôn là DNA hay RNA mà có tên phản ứng là PCR hay RT- PCR.
Các bước cơ bản trong 1 phản ứng PCR gồm 3 bước :
Bước 1: Biến tính: Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiêt độ cao (92 - 94°C) trong thời gian ngắn (khoảng20 - 60 giây). Ở nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép tách thành sợi đơn.
Bước 2: Gắn mồi: Hỗn hợp phản ứng đựợc đặt ở nhiêt độ gắn mồi (Ta) trong thời gian ngắn. Ta được tính toán tùy thuộc đặc điểm mồi, thường trong khoảng 40 - 60 °C. Ở nhiệt độ này, mồi gắn vào khuôn sợi đơn ở vị trí đặc hiệu.
Bước 3: Tổng hợp sản phẩm PCR: Hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu cho phản ứng tổng hợp chuỗi (72 hoặc 60°C tùy DNA polymerase chịu nhiệt). Trong trường hợp RT-PCR, trước khi thực hiện PCR, cần phải có thêm một bước chuyển khuôn RNA thành cDNA bằng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Hai bước RT và PCR có thể được thực hiện riêng rẽ hay trong cùng một ống phản ứng.
Chẩn đoán, xác định virus trên cây tỏi bằng RT-PCR và giải trình tự
Thiết kế mồi (primer): Cặp mồi đặc hiệu CIFor và CIRev để phát hiện các virus thuộc chi Potyvirus trong phản ứng RT-PCR được cung cấp bởi trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới.
Chiết DNA hoặc RNA tổng số từ mô cây dùng phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987)
Thực hiện phản ứng RT-PCR : Kiểm tra và đánh giá kết quả bằng điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose 1% dùng kít tinh chiết thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di trên agarose. Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp dùng mồi PCR đặc hiệu cho Potyvirus (vùng CI) và gửi đọc tại hãng Macrogen (Hàn Quốc).
3.3.2.1. Qui trình chẩn đoán virus bằng RT-PCR dùng mồi đặc hiệu
Chiết RNA tổng số từ mô cây:
Chuẩn bị:
Bước 1: Đệm chiết (đệm CTAB, Cetyl trimethylammonium bromide) Bước 2: Chloroform: Isoamylalcolhol (24:1)
Bước 3: β Mercaptoethanol (BME) Bước 4: Ethanol 70%
Bước 5: 2-Propanol
Bước 6: Đệm TE (Tris EDTA)
Bước 7: Chày, cối sứ (hoặc tube 1.5 ml và chày nhựa): rửa sạch ngâm trong dung dịch NaOH 3M (1 ngày), rửa lại bằng nước cất rồi hấp vô trùng.
Bước 8: Ống Eppendof 1,5ml
Bước 9: Pipet (1000, 200) và đầu côn Bước 10: Máy li tâm để bàn (13000 g) Bước 11: Bể nhiệt
Quy trình chiết:
Bước 1: Bổ sung BME vào đệm CTAB theo tỉ lệ 10 μl/1 ml đệm ( 100 μl BME : 10 ml CTAB), ủ trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút.
Bước 2: Cân 0,2g mô lá nghiền bằng chày cối sứ trong 1ml đệm CTAB. Lấy dịch nghiền 65oC trong 10 phút.
Bước 3: Ly tâm nhanh 5-10 phút.
Bước 4: Lấy dịch kết tủa 700 μl cho vào tube mới.
Bước 5: Cho chloroform : Isoamyl theo tỷ lệ 24 : 1 vào ống phản ứng, đảo đều.
Bước 6: Ly tâm trong vòng 5 phút.
Bước 7: Lấy dịch kết tủa ( 550 μl) chuyển sang ống mới.
Bước 8: Chiết lại lần hai bằng chloroform như trên ( 400 μl dịch kết tủa). Bước 9: Để lạnh 5 phút.
Bước 10: Ly tâm trong 20 phút. Bước 11: Hút 400 μl dịch kết tủa.
Bước 12: Cho LiCl2 theo tỷ lệ 1:4 thể tích của RNA. Để lạnh 15 phút ở - 20oC.
Bước 13: Ly tâm 10 phút thu cặn RNA tổng số Bước 14: Rửa lần 2 bằng cồn 70 oC (700 μl)
Bước 15: Làm khô cặn RNA bằng cách mở nắp tube để khô trong không khí (trong buồng cấy) tối thiểu 30 phút.
Bước 16: Hòa cặn trong 20-50 μl nước cất 2 lần vô trùng hoặc đệm TE và bảo quản dịch RNA ở -20 oC
Thực hiện phản ứng PCR:
Cho vào mỗi ống phản ứng PCR loại 0.5 ml các thành phần sau:
Thành phần Thể tích cần lấy (μl) Dd H2O 7.8 GoTaq 2X 10 CI-F 0.5 CI-R 0.5 Dream Taq 0.2 RNA tổng số 1 Tổng 20
Cho vào máy PCR và thực hiện phản ứng PCR với điều kiện phản ứng sau:
Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
Khởi đầu biến tính 94 4 phút 1
Các chu kỳ tổng hợp 9452 30 giây35 giây 35
72 1 phút
Kết thúc 72 5 phút 1
3.3.2.2. Kiểm tra kết quả RT-PCR bằng điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc điện âm của axit nucleic. DNA với những kích thước và khối lượng khác nhau, sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường từ cực âm sang cực dương tạo thành các băng khác nhau. Chiều daì đoạn DNA càng ngắn thì di chuyển càng nhanh và ngược lại.
Chuẩn bị:
Bước 1: Pha đệm điện di TAE 1x từ dung dịch gốc (TAE 5x): lấy 100ml TAE 5x cho vào cốc đong, bổ sung thêm 400 ml nước cất, lắc đều.
Bước 2: Chuẩn bị bản gel agarose 1%: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100 ml TAE 1x, cho vào lò vi sóng đun 2 phút để làm tan agarose. Sau khi agarose đã tan hoàn toàn, bổ sung 2 μl Ethidium Bromide, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Khi nhiệt độ của agarose 1% giảm xuống còn khoảng 55oC thì đổ agarose vào khuôn (chú ý không đổ quá dày cũng không quá mỏng, dày ~ 0.8 cm). Để khuôn ở nhiệt độ phòng 30 phút. Khi agarose đông cứng hoàn toàn thì tiến hành điện di sản phẩm PCR.
Bước 4: Cho vào mỗi ống PCR 3 μl đệm cài gel 6X, đảo đều và li tâm trong 5 giây.
Tiến hành:
Bước 1: Sau 30 phút để khuôn ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính giữa lược, rút đều tay để không vỡ giếng).
Bước 2: Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập gel (gel ngập sâu khoảng 1mm).
Bươc 3: Nhỏ mẫu vào giếng. Ngoài các mẫu PCR, cần nhỏ thêm 1 giếng Marker DNA làm chuẩn.
Bước 4: Cắm nguồn điện cho máy điện di, đạt hiệu điện thế 100V trong 20 phút. Bước 5: Sau khoảng 25phút, tắt máy điện di, đặt bản agarose lên máy soi gel (phát tia UV), quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh.