TÍNH SINH HỌC
Chiết xuất và tinh chế glycosid:
Nguyên tắc chung:
• Tuỳ theo mục đích chiếc xuất mà dƣợc liệu cần hoặc không cần diệt enzym. Nếu muốn thu đƣợc các genuin glycosid thì cần ổn định dƣợc liệu. Có trƣờng hơp ngƣời ta cho enzym tác dụng để nâng cao hiệu suất chiết một số chất mong muốn, ví dụ chiết digitoxin trong lá digital hoặc chiết diosgenin trong một số loại củ mài, trong mía dò.
• Tạp chất trong dƣợc liệu đi kèm với glycosid có loại tan trong dầu và loại tan trong nƣớc. Loại tan trong dầu chủ yếu là các chất béo (thƣờng gặp trong hạt), Chất diệp lục (lá),
carotenoid (lá, hoa). Muốn xử lý ngƣời ta thƣờng loại các tạp chất này bằng các dung môi kém phân cực nhƣ ether dầu hoả, hexan, sau đó chiết glycosid bằng cồn (thƣờng dùng cồn thấp độ) hoặc nƣớc.
• Dịch chiết cồn hoặc nƣớc sau khi làm đậm đặc cần đƣợc loại tiếp các chất tan trong dầu bằng cách lắc tiếp với dung môi hữu cơ.
• Trong sản xuất muốn tránh dùng nhiều dung môi hữu cơ
thƣờng trong giai đoạn đầu dƣợc liệu đƣợc chiết bằng nƣớc hoặc cồn thấp độ, nhƣ vậy cũng hạn chế các tạp chất tan trong dầu
• Tạp chất tan trong nƣớc thƣờng là các chất gôm, chất nhầy, peetin, tanin… Nếu chiết bằng nƣớc hoặc cồn thấp độ thì các tạp chất này thƣờng tan theo, muốn loại, ta có thể dùng chì
acetat, sau đó loại chì axetat thừa bằng Natri sulfat. Chú ý rằng một số glycosid có thể bị tủa bởi chì acetat (ví dụ flavonoid
glycosid ) trong trƣờng hợp này ngƣời ta còn lợi dụng tủa với muối chì để tách glycosid.
Muốn hạn chế bớt các tạp chất còn có thể tiến hành nhƣ sau: từ dịch chiết nƣớc hoặc dịch chiết cồn đã làm đậm đặc và thêm nƣớc, ngƣời ta lắc với butanol hoặc hỗn hợp
choloroform-ethanol, lấy lớp dung môi hữu cơ rồi bốc hơi. Để loại tanin có thể cho dịch chiết nƣớc hoặc cồn qua cột chứa nhôm oxít.
• Trong nghiên cứu muốn thu đƣợc chất tinh khiết ngƣời ta thƣờng dùng các phƣơng pháp: sắc ký cột, sắt ký chế hoá. (SGK hoặc S.K.L.M.) phƣơng pháp phân bố ngƣợc dòng, thăng hoa chân không ở các nhiệt độ và áp suất khác nhau hoặc kết tinh phân đoạn trong các dung môi thích hợp. Muốn chiết phần aglycon thì cần phải thủy phân rồi chiết bằng dung môi hữu cơ.
• Giai đoạn tinh chế thƣờng công phu và tuỳ theo mỗi loại glycosid mà có phƣơng pháp tinh chế khác nhau.
• Ví dụ muốn tinh chế saponin, có thể tiến hành thẩm tích hoặc lọc qua gel, các steroid glycosid thì dùng phƣơng pháp kết hợp cholesterol, một số glycosid có thể tinh chế bằng cách hoà tan trong một lƣợng cồn vừa đủ rồi thêm một lƣợng lớn dung môi hữu cơ nhƣ ete, hexan, axeton, glycosid sẽ kết tủa.
• Để tách các glycosid thì dùng etanol hoặc metanol với các độ cồn khác nhau, còn tách aglycon, dùng các dung môi hƣu cơ theo độ phân cực tăng dần. Ví dụ CHCl3, tăng dần lƣợng cồn từ (1-5%), theo dõi các phân đoạn bằng đèn tử ngoại.
• Các Sapogenin do không còn phần đƣờng gắn vào chúng, nói chung là các chất phân cực yếu nên rất ít tan trong nƣớc, tan nhiều trong dung môi hữu cơ nhƣ Hexan, Heptan, Ete dầu, Benzen, Axeton, Cồn.
• Tùy yêu cầu của nghiên cứu và sản xuất, cần chiết chúng dƣới dạng Saponin hoặc Sapogenin mà chọn cách chiết và dung môi thích hợp.
Chiết saponin:
Có 2 cách chiết : chiết nƣớc hoặc chiết cồn. 1.Chiết nƣớc
• Dƣợc liệu tƣơi (thân, củ, hoa, lá, quả...) xay bột ngâm với nƣớc một thời gian (6-12 giờ). Ép. Dùng ít nƣớc rửa bả. Dịch ép thu đƣợc, lắc với benzen vài lần để loại chất béo. Dịch nƣớc loại chất béo xong, chiết Saponin bằng Butanol bảo hòa nƣớc. Dịch chiết Butanol đem cất thu hồi dung môi. Các thứ đƣợc hòa tan trong một thể tích nhỏ Etanol. Cho vào dung dịch này một
lƣợng gấp 3 – 4 lần thể tích dung dịch Saponin 1 hỗn hợp gồm ête – axeton (1:4) Saponin kết tủa. Để lắng, lọc, thu lấy kết tủa. Dịch lọc cho thêm một lƣợng ete-axeton khác vào để kết tủa hết Saponin.
• Saponin thô thu đƣợc đem tinh chế và kết tinh trong cồn + Axeton. Nếu là dƣợc liệu thô thì làm bột thô, chiết nƣớc nóng. Dịch chiết cô đặc rồi tiến hành chiết Saponin bằng Butanol nhƣ trên.
2. Chiết cồn.
• Bột dƣợc liệu khô chiết nóng, hoặc ngâm kiệt với Etanol hoặc Metanol 80%. Dịch chiết cất thu hồi cồn còn nƣớc. Lắc dung dịch Saponin đậm đặc này với benzen để loại chất béo. Sau đó chiết Saponin bằng Butanol bão hòa nƣớc. Cất thu hồi butanol. Cặn thu đƣợc hòa vào 1 ít Etanol và kết tủa Saponin từ dung dịch này bằng hỗn hợp ete-axeton nhƣ trên.
• Trong nghiên cứu, có thể kết tủa Saponin từ dung dịch nƣớc bằng Cholesterol hoặc Stearin. Phức hợp tủa đƣợc lọc lấy riêng (thƣờng áp dụng để định lƣợng Saponin)
• Các saponin axit có thể kết tủa dƣới dạng muối amoni hoặc
Natri. Cũng có thể áp dụng tách Saponin bằng cột trao đổi ion : dịch chiết Saponin cho chảy qua cột anion. Sau đó đẩy
Saponin ra khỏi cột bằng dung dịch anton (Ví dụ : dung dịch axit axetic hoặc Clohydric). Cuối cùng, rửa lấy Saponin bằng cồn.
Chiết sapogenin :
Cách chiết lấy thẳng Sapoegenin thƣờng áp dụng trong sản xuất, nhất là sản xuất Sapogenin steroid.
• Để chiết lấy Sapogenin, cần có giai đoạn thủy phân Saponin thành Sapogetin trƣớc khi chiết.
• Dƣợc liệu tƣơi xay nhỏ hoặc bột dƣợc liệu khô ngâm nƣớc ấm 37-40oC. Nếu cần có thêm một lƣợng enzim thủy phân
(thực vật hoặc vi sinh). Thƣờng thƣờng, men thủy phân có sẵn trong dƣợc liệu tƣơi cũng đủ để tự thủy phân Saponin. Thời gian thủy phân tùy thuộc vào bản chất của từng loại Saponin, thƣờng từ 48 – 72 giờ.
• Nếu thủy phân bằng axit thì dùng H2SO4 hoặc HCl. Đối với các sapogenin có dây nối đôi trong cấu trúc (Ví dụ : Sapogenin Steroid có Ds) nên dùng H2SO4.
• Bột dƣợc liệu cho vào nƣớc, thêm axit đến pH 1 – 2 (thƣờng từ 5 – 10%) đun sôi 3 – 6 giờ tùy theo loại Saponin. Để nguội lọc cả cặn thu đƣợc bã dƣợc liệu đem sấy khô. Sau đó chiết
Sapogenin bằng dung môi hữu cơ nóng (hồi lƣu hoặc Soxhlet). Dung môi có thể dùng là Hexan, Ete dầu, Benzen hoặc cồn.
Trong sản xuất công nghiệp, có thể dùng loại xăng công nghiệp tinh chế lại bằng cách cất để làm dung môi chiết xuất.
• Có thể phối hợp cả 2 cách trong việc thủy phân Saponin : thủy phân bằng enzim trƣớc, sau đó thủy phân tiếp bằng axit. • Thủy phân Saponin (nói chung là glycozid) là khâu kỹ thuật
rất quan trọng. Cần nghiên cứu các yếu tố nhƣ nồng độ axit, nhiệt độ và thời gian thủy phân sao cho thích hợp, vừa thủy
phân đƣợc triệt để đồng thời bảo tồn đƣợc Sapogenin không bị phá hủy hoặc biến đổi cấu trúc.
Tinh chế saponin
Để tinh chế, có thể thực hiện với các phƣơng pháp sau: a/Thẩm tích.
• Dùng bột Mg oxit hoặc bột polyamid để tách ra khỏi tanin.
Saponin đƣợc hoà tan vào nƣớc rồi trộn với bột polyamid hoặc bột Mg oxit trên nồi cách thuỷ 10 phút để có một khối nhão.
Sau đó chiết saponin từ khối nhão này bằng etanol 80% nóng. Lọc rồi bốc hơi
b/Dùng Sephadex G-25,G-50,G-75:
• Lƣợng Sephadex dùng gấp 50 lần saponin đem ngâm nƣớc cất cho trƣơng lên, gạn lƣợng nƣớc thừa, cho gel vào cột sắc ký.
c/Để tinh chế saponin steroid có thể dùng phƣơng pháp kết hợp với cholesterol:
1g saponin hoà trong 200ml etanol đã đun nóng, tủa phức sẽ tạo thành. Sau khi nguội đem lọc tủa và sấy khô. Phá phức bằng cách hoà tan trong Pyridin. Saponin tinh khiết sẽ đƣợc tủa trong ete. Để loại hết cholesterol, tủa đƣợc hoà tan trong metanol rồi lại tủa với ete.
Chiết xuất và tinh chế flavonoid
Nguyên tắc chung:
• Không có một phƣơng pháp chung nào để chiết xuất các
favonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nƣớc và trong các dung môi hữu cơ.
• Các flavonoid glycosid thƣờng dễ tan trong các dung môi phân cực.
• Các flavon, flavonol có OH tự do ở vị trí 7 tan đƣợc trong dung dịch kiềm loãng. Dựa vào đó để chiết.
• Ví dụ để chiết rutin trong hoa hoè ta có thể dùng dung dịch kiềm Na2CO3 loãng để hoà tan flavonoid ra khỏi nguyện liệu, sau đó acid hoá bằng HCl để kết tủa lại rutin.
• Thông thƣờng để chiết các flavonoid glycosid, ngƣời ta phải loại các chất thân dẫu bằng ete dầu hoả sau đó chiết bằng nƣớc nóng hoặc metanol hoặc etanol hay hỗn hợp CHCl3 và etanol. • Cồn ở các nồng độ khác nhau và nƣớc thƣờng chiết đƣợc phần lớn các flavonoid. • Hỗn hợp CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy flavonoid. • Các chất anthocyamin thƣờng kém bền vững nhất là các acyl anthocyanin đƣợc acyl hoá với các axít aliphatic do đó ngƣời ta thƣờng chiết bằng metanol có mặt của các acid yếu nhƣ acid acetic, tactaric thay vì HCl.
• Để phân lập từng chất flavonoid ngƣời ta áp dụng phƣơng pháp sắc ký cột. Chất hấp thụ thông dụng là bột polyamid. Có thể dùng các chất khác nhƣ bột cellulose, silicagel, magnesol, polyvinylpyrolidon. Silicagel dùng để tách các chất flavonon, isoflavon.
• Polyamid dùng để tách tất cả các loại flavonoid, khai triển bằng etanol hoặc metanol với độ cồn giảm dần, hoặc một số hỗn
hợp dung môi khác.
• Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần hoặc sắc ký chế hoá. Các flavonoid dimer, trimer có thể tách bằng sephadex LH-20.
Chiết xuất flavonoid:
• Độ hòa tan của flavonoid tùy thuộc vào số nhóm hydroxy và cac nhóm thể khác của chúng. Số nhóm này cũng nhƣ vị trí của chúng rất khác nhau giữa flavonoid, vì vậy khó mà định một đƣờng lối chung về chiết xuất. Tuy thế, có thể nêu ra một số nguyên tắc chung nhƣ sau :
• Flavonoid ở hầu hết bộ phận của cây : rễ, gỗ, lá, hoa, quả, hạt, sáp.
• Các flavon và flavonol có nhiều OH, các biflavon, auron,
chalcon và glycozid đều là những chất phân cực mạnh. Có thể chiết chúng bằng cồn, nƣớc riêng hoặc hỗn hợp. Dung môi có thể áp dụng cho hầu hết flavonoid là dung dịch cồn 80 hoặc 60% (EtOH, McOH)
• Chiết bằng nƣớc nóng áp dụng tốt đối với các polyglycozid (nhƣ trƣờng hợp chiết Rutin từ hoa hòe) và các antoxyanin. Đối với antoxyanin, nên cho thêm lƣợng nhỏ HCl vào nƣớc chiết nóng dƣới dạng clorua, vì chúng khá bền vững với nhiệt độ.
• Flavonoid do có các nhóm OH phenol, chúng tan đƣợc trong kiềm. Lợi dụng tính chất này, có thể chiết chúng bằng dung
dịch kiềm loãng, nƣớc vôi. Sau đó axit hóa dịch chiết để kết tủa flavonoid hoặc tách ra bằng dung môi hữu cơ ở môi trƣờng
axit.
Chiết xuất, tinh chế và phân lập alcaloid
Chiết xuất.
Việc chiết xuất alcaloid dựa vào tính chất chung sau:
• Alcaloid nói chung là những bazơ yếu thƣờng tồn tại trong cây dƣới dạng muối acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; nên phải tán nhỏ dƣợc liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alcaloid khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh.
• Hầu hết các alcaloid bazơ không tan trong nƣớc nh-ƣng lại dễ tan trong dụng dịch hữu cơ ít phân cực (hydrocacbon thơm, chloroform, ether). Trái lại, các muối alkaloid thƣờng tan trong nƣớc, cồn và không tan trong các dung môi ít phân cực. Mặt khác còn tuỳ theo tính chất của alcaloid nhƣ- loại bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phƣơng pháp chiết suất cho thích hợp.
• Đối với những alcaloid bay hơi đƣợc nhƣ- coniin (trong cây
Conium Maculatum), nicotin (trong cây thuốc lá) spactein (trong cây Cytisus scopanus) ... có thể cất kéo đƣợc bằng hơi nƣớc thì sau khi sấy khô dƣợc liệu, tán nhỏ, cho kiềm vào để đẩy alcaloid dạng muối ra dạng bazơ rồi lấy alcaloid ra khỏi đƣợc liệu theo phƣơng pháp cất kéo bằng hơi nƣớc, ngƣời ta
thƣờng hứng dịch cất đƣợc vào trong dụng dịch acid và từ đó có thể đƣợc muối alcaloid.
• Đối với Những alcaloid không bay hơi ngƣời ta sử dụng những phƣơng pháp sau:
a/ Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trƣờng kiềm:
• - Tán nhỏ dƣợc liệu rồi tẩm bột dƣợc liệu với dung dịch kiềm trong nƣớc.
• - Chiết bột dƣợc liệu sau khi đã kiềm hoá nh-ƣ trên bằng dụng môi hữu cơ không phân cực thích hợp, dụng môi này hoà tan các alcaloid bazơ vừa đƣợc giải phóng.
• - Cất thu hồi dung môi hữu cơ dƣới áp lực giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dụng dịch acid loãng (2 - 5%), (thƣờng dùng acid hydrochloric, acid sulfunc, đôi khi dùng acid axetic hoặc acid focmic). Các alcaloid đƣợc chuyển sang dạng muối tan trong nƣớc, còn mỡ, sắc tố sterol … ở lại dung môi hữu cơ. • - Góp các dịch chiết muối alcaloid lại rồi kiềm hoá để chuyển
alcaloid sang dạng bazơ, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alcaloid bazơ.
b/ Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nƣớc. • - Thấm ẩm bột đƣợc liệu bằng dung môi chiết xuất.
• - Chiết bột dƣợc liệu bằng dung môi chiết xuất các alcaloid trong dƣợc liệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên.
• - Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dƣới áp lực
giảm, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc còn lại ở môi tr-ƣờng acid ether thƣờng hoà tan một số tạp chất chứ không hoà tan các alcaloid.
• - Sau khi tách lớp ether, kiềm hoá dung dịch nƣớc rồi lấy
alcaloid bazơ đƣợc giải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp, (dung môi này phải không trộn lẫn với dung dịch nƣớc) thƣờng dùng cloroform, ether, benzen ... Cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu đƣợc cặn alcaloid thô.
• Phƣơng pháp này còn gọi là phƣơng pháp STAS - OTTO.
c/ Chiết bằng cồn.
• Có một số alcaloid trong dƣợc liệu tồn tại dƣới dạng muối tan iốt trong cồn ở môi trƣờng trung tính. Do đó sau khi tán nhỏ dƣợc liệu ở kích thƣớc thích hợp đen thấm ẩm và chiết bằng cồn etylic cho tới kiệt alcaloid. Quá trình tiếp theo đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ ở trên.
• Trong quá trình chiết xuất ngƣời ta dùng thuốc thử tạo tủa để kiểm tra xem các alcaloid đã lấy kiệt chƣa.
Tinh chế và phân lập:
• Sau khi chiết xuất ít khi thu đƣợc một alcaloid tinh khiết mà thƣờng là một hỗn hợp các alcaloid còn lẫn tạp chất.
• Nếu chỉ có một alcaloid thô thì có thể tinh chế bằng cách
chuyển nó nhiều lần từ dung môi hữu cơ sang dung môi nƣớc và ngƣ-ợc lại, cuối cùng làm bốc hơi dung môi nƣớc ta đƣợc một alcaloid tinh khiết.
• Nếu là hỗn hợp nhiều alcaloid để tinh chế và phân lập riêng từng alcaloid trƣớc đây thƣờng chỉ dùng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn bằng các dung môi, ngày nay ngƣời ta sử dụïng
thêm một số phƣơng pháp khác nh-ƣ: phƣơng pháp trao đổi ion, phƣơng pháp sắc cột, sắc ký lớp chế hoá…