Lên men là giai đoạn quyết định để chuyển hóa dịch đường thành bia dưới tác động của nấm men thông qua hoạt động sống của chúng . Quá trình quan trọng nhất và phức tạp nhất ở giai đoạn này là quá trình lên men rượu của các loại đường ở trong dịch đường. Song song với quá trình lên men rượu hoặc sau đó, trong dịch lên men còn xảy ra rất nhiều quá trình sinh, sinh lý, hóa lý,hóa học và lý học phức tạp khác.Những quá trình này đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc ấn định thành phần và chất lượng của bia.So với quá trình lên men ở các loại cơ chất khác, quá trình lên men từ dịch đường houblon hóa trong công nghệ sản xuất bia mang các nét đặc thù:
Là quá trình lên men đa mục tiêu. Mặc dù phản ứng sinh hóa là sự chuyển hóa đường thành rượu và CO2 nhưng mục tiêu của con người không phải là để thu nhận một lượng tối đa
hai sản phẩm này mà còn phải thu được dịch lên men, trong đó có nhiều cấu tử và tỉ lệ về khối lượng của chúng phải hài hòa, cân đối.
Việc đánh giá chất lượng sản phẩm bia không phải chỉ căn cứ trên hàm lượng sản phẩm chính của quá trình lên men mà còn phải căn cứ vào tập hợp các chỉ số khác.
Một tỉ lệ thích hợp về khối lượng của các cấu tử trong dịch đường houblon hóa cần phải tồn tại ở lại trong bia để cùng với các hợp chất tạo thành trong quá trình lên men bia và sau đó tạo nên những đặc thù riêng về hương, mùi vị.. chi sản phẩm
Lên men rượu là một chuỗi quá trình enzyme hết sức phức tạp nhằm cung cấp cho nấm men năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết trong điều kiện không thuận lợi cho chúng sinh trưởng và phát triển. Do đó, cần phải hiểu rõ, nắm vững một cách sâu sắc và tổng thể các quá trình sinh học xảy ra trong quá trình lên men cũng như các đặc điểm hình thái, hóa sinh và sinh lý của nấm men để đạt được các kết quả tốt đẹp trong công nghệ sản xuất bia.Trong quá trình lên men dịch đường houbon hóa trong sản xuất bia diễn ra hai giai đoạn:
Lên men chính: Đối với sản xuất bia đen là 12-18 ngày, nhiệt độ lên men 6-8oC Lên men phụ và tàng trữ: kéo dài ít nhất 3 tuần . Nhiệt độ lên men phụ 1-2 oC.
Mục đích :
Quá trình lên men chính là quá trình chuyển các chất đường và các dextrin có phân tử thấp thành rượu etylic(C2H5OH), CO2 và một số sản phẩm phụ khác tạo thành bia theo đúng yêu cầu kỹ thuật và chất lượng sản phẩm .
Cơ sở lý thuyết:
Trong quá trình sống, nấm men thông qua con đường trao đổi chất, đường sẽ chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic rồi tiếp tục được chuyển hóa thành ethanol và khí cacbon dioxide theo sơ đồ phản ứng sinh học:
Hình 2.10 Chu trình đường phân
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + Q (năng lượng)
Đồng thời do các quá trình sinh hóa xảy ra do sự xúc tác sinh học của các enzym được hình thành trong quá trình lên men, một số sản phẩm phụ cũng được hình thành như các acid hữu cơ, các ester, các rượu bậc cao, glyxerin…, một số chất hòa tan ban đầu trong dịch đường chuyển sang dạng không hòa tan và bị tách ra ngoài dưới dạng kết lắng.
Tất cả những sự biến đổi này đã dẫn đến sự thay đổi về chất và lượng của các chất hòa tan trong dịch đường lên men và biến dịch đường thành bia. Trên cơ sở biến đổi như vậy, dịch đường ban đầu sau quá trình lên men chính sẽ biến đổi thành bia non. Thành phần chất lượng của bia phụ thuộc vào thành phần của dịch đường, loại nấm men và điều kiện lên men.
Trong công nghệ sản xuất bia, người ta đưa ra khái niệm “độ lên men” để đánh giá mức độ chuyển hóa các chất hòa tan mới trong bia nhờ tác động của nấm men và định nghĩa như sau:
Tổng lượng chất tan đã bị tiêu hao trong thời gian lên men chính ( kể cả phần tiêu hao do kết lắng) gọi là chất chiết đã lên men. Khối lượng chất chiết ( chất hòa tan) đã lên men biểu thị bằng phần trăm so với lượng chất hòa tan ban đầu của dịch đường, gọi là mức độ lên
men hay độ lên men. Trong thành phần chất hòa tan ban đầu trong dịch đường, phần nấm men có khả năng hấp thụ rất lớn gọi là chất chiết có khả năng lên men, phần còn lại nấm men không có khả năng hấp thụ gọi là chất chiết không lên men. Khối lượng của chất chiết có khả năng lên men biểu thị bằng phần trăm theo lượng chất chiết ban đầu trong dịch đường gọi là độ lên men cuối cùng. Theo lý thuyết, thì toàn bộ lượng chất chiết có khả năng lên men có thể sẽ được lên men hoàn toàn . Lúc đó độ lên men sẽ có trị số bằng độ lên men cuối cùng nhưng trong sản xuất không bao giờ độ lên men của một dịch đường lại có thể đạt được đến độ lên men cuối cùng của nó. Do đó cần phải hoàn thiện quy trình lên men, xác định được các điều kiện tối ưu để giảm đến mức thấp nhất sự sai lệch giữa hai chỉ số trên.
Quá trình lên men chính để chuyển hóa dịch đường thành bia non thông qua những quá trình cơ bản sau:
Quá trình sinh lý thể hiện ở giai đoạn đầu. Thực chất đây là giai đoạn lên men hiếu khí, nhờ vậy nấm men sinh sản nhanh, mạnh mẽ, sự sinh tổng hợp một lượng lớn enzym zimaza (Zimaza là một tổ hợp enzyme xúc tác quá trình chuyển hóa của đường hexoza thành rượu mà bản thân chúng mang trong mình những chất đồng hành cần thiết: chất hoạt hóa, cofactor) trong những tế bào nấm men, đây sẽ là yếu tố chính thúc đẩy cường độ lên men ở những giai đoạn kế tiếp.
Quá trình sinh hóa tăng mạnh dần ở giai đoạn thứ hai. Vào cuối giai đoạn lên men, hiếu khí dần chuyển sang lên men kỵ khí. Đặc trưng của giai đoạn này là hoạt hóa mạnh các hệ enzym zimaza, chuyển hóa các chất đường thành C2H5OH và CO2. Nấm men sử dụng các hydratcacbon theo quy luật bắt đầu từ những đường đơn giản nhất (glucoza, fructoza) trở đi. Vì vậy các đường đơn thường bị giảm rất nhanh ở giai đọan đầu. Khi đã cạn nguồn đường đơn, nấm men sẽ tấn công đến các đường kép saccaroza nhờ enzym invertaza để chuyển thành glucoza và fructoza. Với đường maltoza thì nhờ enzym maltoza để chuyển thành glucoza hoàn toàn. Đối với maltodextrin trong lên men chính nấm men chỉ sử dụng một phần, phần còn lại sẽ được sử dụng tiếp ở lên men phụ.
Trong quá trình lên men chính, ngoài sự chuyển hóa các chất hydratcacbon, nấm men cũng hóa một số hợp chất khác như protein, khoáng, béo…từ đó dẫn tới sự hình thành khá nhiều những thành phần phụ trong sản phẩm bia (các rượu bậc cao, glyxerin…), phần lớn những thành phần này thường gây cho bia có mùi vị khó chịu và hình thành nhiều nhất ở giai đoạn lên men chính.
Quá trình lên men có thể chia làm bốn giai đoạn. Mỗi giai đoạn đều có những biểu hiện và dấu hiệu đặc trưng với mức độ khác nhau của sự thay đổi hàm lượng chất hòa tan, nhiệt độ và các dấu hiệu bề ngoài của dịch lên men, đặc biệt là hình thái và màu sắc của bọt.
•Giai đoạn 1: Giai đoạn kéo dài 1-2 ngày đêm
Nấm men nảy chồi phát triển mạnh dần và tăng sinh khối Nhiệt độ tăng 0,5oC. Đồng thời xuất hiện các vành bọt, cuối giai đoạn này hình thành lớp bọt mỏng trên bề mặt môi trường lên men. Bọt nhỏ, mịn và trắng.Nồng độ chất hoà tan trong dịch đường giảm 0,3-0,5%
Giai đoạn này chủ yếu là lên men hiếu khí, phương trình lên men: C6H12O6 + O2 6CO2 + 6H2O + Q
• Giai đoạn 2: Bao gồm 2-3 ngày đêm tiếp theo
Đặc điểm của giai đoạn này là nấm men đã phát triển đén mực độ cực đại. Tốc độ lên men nhanh.Quá trình lên men chuyển từ lên men hiếu khí sang kị khí để tạo etanol:
C6H12O6 C2H5OH + 2CO2 + Q
Lúc này lượng CO2 tạo ra nhiều hơn vừa có xu hướng thoát ra ngoài. Trên mặt bong bóng của những dạng bột li ti này hình thành một lớp hấp phụ đơn phân gồm những chất như: protein, chất đắng, polyphenol…những chất này có sức căng bề mặt tốt làm cho CO2 khó thoát ra ngoài chúng bị hấp phụ với nhau tạo thành bọt. Đồng thời nồng độ chất hoà tan trong dịch đường giảm mạnh mỗi ngày(0,7-1%/ ngày đêm) và nhiệt độ tăng nhanh hơn 1-1,5 oC
• Giai đoạn 3: Kéo dài từ 2 ÷ 3 ngày tiếp theo.
Trong giai đoạn này sự lên men xảy ra mãnh liệt nhất, nồng độ chất hoà tan giảm nhanh nhất, và nhiệt độ tăng rất nhanh, CO2 thoát ra nhiều nhất và được thu hồi để tái sử dụng, bột bồng lên rất cao, bề mặt trắng dần chuyển sang xám do sự oxy hoá các chất trên bề mặt. Sang đến cuối giai đoạn này thì bọt bắt đầu xẹp xuống. Hàm lượng chất hòa tan giảm 2,5-3% còn nhiệt độ có xu hướng tăng rất mạnh.Cần theo dõi nhiệt độ để điều chỉnh kịp thời. Ở giai đoạn này môi trường lên men tạo ra nhiều diacetyl nhất.
• Giai đoạn 4: Kéo dài từ 1 ÷ 2 ngày cuối cùng.
Giai đoạn này cường độ lên men yếu dần, nồng độ chất hoà tan giảm chậm. Khi kiểm tra hàm lượng chất hoà tan giảm còn 30 ÷ 35% so với lúc ban đầu thì dừng quá trình lên men chính. Lúc này nhiệt độ ổn định theo chiều hướng giảm dần. Bọt xẹp hết, trên bề mặt của bia non phủ một lớp bột màu xám –nâu, sinh khối nấm men cùng các thành phần keo tụ của nhựa đắng, protein, tannin, houblon…lắng xuống đáy, bia non dần dần trong hơn.
Hấp thụ dinh dưỡng của nấm men
• Hấp thụ cacbon
Nguồn cacbon cho nấm men là các loại đường và dextrin phân tử thấp có trong dịch đường houblon hóa. Các loại đường đơn như glucoza, fructoza, manoza, galactoza bị lên men trực tiếp. Các loại disaccharide và một số oligosaccharide được lên men sau khi bị thủy phân bởi enzyme của nấm men. Từ thực nghiệm và các quan sát đã chứng tỏ rằng sự lên men các loại đường riêng biệt được xảy ra theo một trình tự nhất định với các tốc độ khác nhau vì các loại đường có kích thước phân tử và cấu trúc khác nhau do đó khả năng và tốc độ thẩm thấu của chúng qua màng tế bào của nấm men cũng khác nhau . Thông thường lên men nhanh nhất là glucoza sau đó là fructoza, maltoza và tiếp theo là các loại đường khác.
• Quá trình hấp thụ axit amin.
Một phần của các hợp chất chứa nitơ trong dịch đường được nấm men hấp thụ, một phần khác bị keo tụ và kết lắng xuống đáy thùng lên men hoặc lơ lửng nổi trên bề mặt của bia non. Điều đó dẫn đến hàm lượng các hợp chất chứa nitơ giảm mạnh. Mặt khác trong quá trình lên men, một số tế bào bị phân rã. Các hợp chất chứa nitơ được giải phóng ra hòa tan vào dịch lên men. Nhờ có quá trình này mà nitơ mất đi đã được phần nào bù đắp lại .
Nấm men hấp thụ đạm vô cơ và các loại đạm hữu cơ phân tử thấp,chủ yếu là các axit amin và một số amid. Các axit amin trong dịch đường được chuyển hóa theo hai cách. Ban đầu các axit amin này được đưa vào trong tế bào và tham gia trực tiếp tạo thành protein của nấm men. Sau đó nhóm amin được chuyển thành một enzyme( transaminaza) và sự duy trì bộ khung được tiết ra hay được dử dụng để tạo thành NAD+.Chuyển amin được decarboxyl hóa để tạo thành andehyt và CO2. Sau đó andehyt này được khử thành rượu. Rượu này được tạo thành từ rườu bậc cao hay rượu fusel.
• Sự chuyển hóa chất béo
Sinh tổng hợp các tế bào nấm men mới trong quá trình lên men đòi hỏi sự tổng hợp các lipit. Những đại phân tử này chủ yếu được tìm thấy là các thành phần quan trọng của màng tế bào. Thông thường màng tế bào của nấm men có chứa các sterol. Quá trình tổng hợp các chất béo và sterol cần thiết bắt đầu từ coenzyme A để tạo thành các phân tử axetyl coenzyme A để tạo thành các phân tử axyl CoA và sterol bão hòa và không bão hòa.Quá trình sinh tổng hợp của các phần tử và các sterol không bão hòa đòi hỏi một bước oxy hóa; quá trình oxy hóa đạt được nhờ có oxy phân tử .Các loại nấm men khác nhau đòi hỏi lượng oxy khác nhau mà nhu cầu về oxy được thay thế trong quá trình lên men. Sự thiếu hụt oxy dẫn đến quá trình lên men nghèo nàn và có thể dẫn đến việc tăng mức axetyl coenzyme A trong các tế bào. Điều này làm
tăng hàm lượng ester trong bia làm ảnh hưởng đáng kể đến hương. Do đó việc cung cấp đủ lượng oxy ban đầu vào dịch đường chuyển vào lên men là rất quan trọng trong việc đảm bào cho môi trường lên men thích hợp.
Sinh tổng hợp các sản phẩm bậc hai
Ngoài những sản phẩm chính được tạo thành:etylic, CO2, trong quá trình lên men chính còn tạo ra nhiều sản phẩm bậc hai( sản phẩm phụ). Những sản phẩm này đều có vai trò quan trọng trong việc hình thành hương và vị của bia, mặc dù vai trò đó có thể là tích cự hoặc tiêu cực . Một số sản phẩm thường gặp:
• Rượu bậc cao
Các rượu bậc cao là những thành phần chính của dầu fusel. Ngoài ra trong dầu fusel còn có axit dễ bay hơi, ester và andehyt. Khối lượng và thành phần của rượu bậc cao còn phụ thuộc vào thành phần dịch đường, chủng nấm men, nhiệt độ. Ở trong bia chứa các loại rượu bậc cao như: propylic,izopropylic,butylic,izobutylic,amylic,izoamyli và nhiều loại khác.Khối lượng của chúng dao động trong một khoảng rộng từ 20-95mg nhưng thông thường là khoảng 50-60mg/l. Ở điều kiện lên men nổi hàm lượng rượu bậc cao ở trong bia cao hơn so với lên men chìm. Phần lớn các rượu bậc cao này đều làm cho sản phẩm bia có mùi khó chịu gây ảnh hưởng tiêu cực đến tính chất cảm quan của bia. Các rượu này được hình thành nhiều nhất trong quá trình lên men chính đặc biệt ở pha logarit. Hàm lượng của chúng trong quá trình lên men phụ tăng không đáng kể. Trong nhiều trường hợp ta còn thấy hàm lượng của chúng giảm đi.
R-CO-COOH -> R-CHO+CO2+ H2O R-CHO+R-CHO -> R-CH2OH+R-COOH
Cùng với rượu bậc cao,glyxerin cũng được hình thành trong quá trình lên men chính. Chúng được hình thành khi các aldehyt glyceric bị khử. Aldehyt glyceric được hình thành khi Fructozodiphotphat bị phá vỡ dưới dạng aldehyt glyceric và photphodioxyxeton. Ngoài ra, glyxerin khi đề amin hóa axit glutamic. Trong bia có hàm lượng glyxerin từ 1,5-3g/l. Glyxerin có tác dụng làm bia có vị mềm hơn, tăng độ dậm đà của sản phẩm và tăng khả năng giữ CO2.
• Các axit hữu cơ
Trong quá trình lên men chính, một số axit hữu cơ được tạo thành, một phần là sản phẩm phụ của sự lên men đường, một phần là kết quả của sự trao đổi chất của nấm men, axit hữu cơ cũng là sản phẩm của sự đồng lên men do vi khuẩn gây ra khi dịch đường bị nhiễm. Axit lactic và xitric hình thành trong lên men chính từ axit piruvic.Trong trường hợp này axit pyruvic không bị decacboxyl mà là bị khử thành axit lactic. Hàm lượng trung bình của chúng
ở trong bia khoảng 150-200ml. Khi dich lên men bị nhiễm khuẩn lactic thì hàm lượng của chúng tăng vọt lên rất nhiều lần. Axit sucxinic cũng được tạo thành bởi sự deamin hóa axit glutamic hoặc qua phản ứng chuyển amin. Hàm lượng axit sucxinic có trong bia thường từ 60-70mg/l, trong khi lên men, một số axit dễ bay hơi như axetic, formic cũng được tạo thành. Thông thường axit axetic trong bia80-100mg/l, axit formic là 25-30mg/l.
Trong trường hợp thứ nhất, chất nhận hydro là aldehyt trizoglyxerinic. Sản phẩm thu