3. Kết quả và bàn luận
3.3.2. Kết quả phân tích RAPD-PCR
Trong m ột thí nghiệm sơ bộ, từ tổng sỏ' khoảng 20 mồi RAPD-PCR được sử dụng trong thí nghiệm , chúng tôi xác định được 12 mồi cho kết quả các băng điện di các phân đoạn ADN được khuếch đại rõ nét, bao gồm các mồi OPA-3, OPA-4, OPA-5, OPA-6, OPA-IO, OPA-14, O PA -18, OPC-4, OPC-IO, OPC-13, OPC-15 và OPC-18. Các mồi này sau đó đã được sử dụng để khuếch đại các phân đoạn ADN từ các dòng Râu mèo được thu thập. Kết quả phân tích ADN khi sử dụng 12 mồi ở 10 dòng Râu mèo đã thu được tổng cộng 450 phân đoạn ADN được khuếch đại, trong đó có 57 băng đa hình (số liệu được tổng kết trên Bảng 6). Như vậy, trung hình mỗi mồi cho từ 4-5 phân đoạn ADN được khuếch đại có kích thước khác nhau. Một điều đáng chú ý là phổ điện di RAPD- PCR sử dụng các m ồi khác nhau nhìn chung cho thấy tính đồng hình tương đối cao ớ phần lớn các dòng R âu m èo được thu thập trong nghiên cứu này. Điều này đặc biệt rõ đối với các dòng H N lt H N 2, H N 3, PTj, PT2, PT3, TH(), TH ,, và TH 2, tức là các dòng được thu tại khu vực phía Bắc. Cụ thể, các mồi OPC-4 và OPA-18 đều tạo ra ba băng đồng hình ở cả 10 dòng R âu m èo nghiên cứu (xem minh họa Hình 17). Trừ dòng Ráu mèo QN, (thu ở H uyện Trà M y, Tỉnh Quảng Nam) tách ra thành nhóm riêng, tất cả các dòng Râu mèo còn lại đều cho thấy mức độ đồng hình di truyền tương đỏi cao. Chín dòng Râu mèo đươc thu thâp ở H à Nội, Thanh Hóa và Phú Thọ cùng chia se 4/6 băng điện di cac phân đoạn ADN được khuếch đại bằng mồi OPA-14 là các băng đồng hình. Đối với các dòng này tỉ sô giữa sô băng đồng hình trẽn tông sô các bâng ADN được khuech đại khi sử dụng các mồi O PA -5, O PA -6, OPA-4, OPC-IO, OPC-15 và OPA-3 tương ứng là 4/5. 3/5, 4/7, 3/4, 5/6 và 3/5.
Cấu trúc di truyền gần giống nhau của 9 dòng Râu mèo được thư thập ơ Hà Nội, Thanh Hóa, Phú Thọ cho thấy nhiều khả năng 9 dòng này cùng xuất sứ từ một nguồn
gốc. Đáng chú ý là cây Râu mèo gần đây chỉ chủ yếu được nhân giống bằng các biện pháp vô tính (cắt cành, giâm hom). Hơn nữa, kết quả điều tra của chúng tôi cho thấy diện tích phân bô' của loài này ở khu vực M iền Bắc Việt Nam là tương đối hẹp. Vì vậy những yếu tố trên đây có thể đã góp phần dẫn đến hiện tượng đồng hình di truyền cao ờ các dòng Râu m èo được thu ở khu vực phía Bắc.
Trên cơ sở các số liệu RAPD-PCR, chúng tôi đã xác định được hệ số đồng dạng và khoảng cách di truyền giữa các dòng Râu M èo được sử dụng trong nghiên cứu dựa trên hệ số Nei (Nei và cs, 1994; Rolhf, 1993) bằng chương trình phần mềm NTSYSpc 2.02h. Kết quả được trình bày trên Bảng 6 và Hình 16.
Bảng 6. Số băng AD N được khuếch đại bằng kỹ thuật RAPD-PCR thu được từ 10 dòng Râu m èo được thu thập ở M iền Bắc và M iền Trung, Việt Nam
NSs iDòng
Mồi HN, h n2 HN, PT, p t2 PT, TH0 TH, t h2 QN, Số các phán đoạn RAPDđa hình
OPA-3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 OPA-4 7 7 7 4 4 4 4 4 4 0 7 OPA-IO 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 4 OPA-14 6 6 6 4 4 5 4 4 4 4 6 OPA-18 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 OPA-5 4 4 5 4 4 4 4 5 5 0 5 OPA-6 4 4 4 5 5 5 3 4 4 4 5 OPC-IO 4 3 3 4 4 4 4 4 4 2 4 OPC-13 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 4 OPC-15 5 5 5 6 6 5 6 6 6 4 6 OPC-18 4 4 4 5 5 5 3 3 3 0 5 OPC-4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Tổng số phân đoạn 49 48 49 46 46 43 45 47 47 30 4 5 0 ^ ^ .
Từ sô liệu về hệ sô khoảng cách di truyền (Bảng 7) và sơ đô cây quan hệ di truyen (Hình 16) có thể thấy 10 dòng Râu mèo được thu thập trong nghiên cứu này có thể chia thành 4 nhóm chính. N hóm thứ nhất gồm các dòng thu thập ớ Hà Nội (HN,. HN2. HNO có khoảng cách di truyền dao động trong khoảng 0,00 - 0.19. Nhóm thứ hai gồm các dòng thu ở Phú Thọ (PT,. PT: và PT3), có hệ số khoảng cách di truyền trong khoảng 0.13
- 0,19. N hóm thứ ba gồm các dòng thu thập ở Thanh Hóa (TH„, TH, và TH2) có hệ sô khoảng cách di truyền dao động trong khoảng 0,13 và 0,19. Nhóm thứ tư gồm một dòng duy nhất thu ở Trà M y, Q uảng Nam (Q N ,), nằm tách biệt khỏi các dòng còn lại, với hệ số khoảng cách di truyền so với các dòng khác dao động từ 0,59 đến 0,62. Sự tương đồng di truyền giữa các dòng thuộc nhóm thứ nhất và thứ hai cũng tương đối cao hệ sô khoảng cách di truyền giữa các dòng thuộc hai nhóm này dao động trong khoảng 0,32 và 0,35. Đáng chú ý, có tương đồng giữa các nhóm dòng cây được thu từ cùng địa phương với hộ số tương đổng di truyền giữa chúng. Hay nói cách khác, các việc phân nhóm các dòng Râu m èo được thu thập trong nghiên cứu này dựa trên chỉ thị RAPD-PCR cũng tương ứng với các địa phương tiến hành thu thập mẫu.
Hệ số tương đồng di truyền
H ìn h 16. M ối quan hệ di truyền được xác định trên cơ sở chỉ thị RAPD- PCR giữa 10 dòng Râu M èo (Orthosiphon stamineus Benth.) được thu thập trong nghiên cứu.
Sự đa hình di truyền không cao của các dòng Râu M èo được tìm thây ở miên Bãc nước ta nhờ kết quả phân tích chỉ thị RAPD-PCR cho thấy đê có thê tiên hành cóng tac chọn tạo giống ở loài cây thuốc này, việc cần làm hiện nay là cần phải bảo tôn các dòng cây này, đổng thời cần du nhập thêm các dòng/giống, tức là nguồn gen mới, của cây Ràu Mèo từ các địa phương khác hoặc từ nước ngoài để làm tãng tính đa dang về vốn gen. phục vụ cho mục đích chọn tạo các giống Râu mèo có hàm lượng cao của hợp chát sinensetin hoặc có hoạt tính sinh học cao.
Bảng 7. Hệ số khoảng cách di truyền giữa các dòng cây Râu M èo (Oìthosiphon stamineus
_______ Benth.) thu thập ò V iệt Nam dựa trẽn chỉ thi RAPD-PCR___________
H N 3 H N 2 HN, TH 2 TH, THo PT, PT2 PT3 QN, h n3 0,00 h n2 0,19 0,00 H N , 0,19 0,00 0,00 t h2 0,40 0,40 0,40 0,00 TH , 0,42 0,42 0,42 0,13 0,00 THo 0,44 0,40 0,40 0,19 0,13 0,00 PT, 0,35 0,35 0,35 0,32 0,35 0,37 0,00 p t2 0,32 0,32 0,32 0,35 0,37 0,40 0,13 0,00 p t3 0,35 0,35 0,35 0,37 0,40 0,42 0,19 0,13 0,00 Q N, 0,61 0,61 0,61 0,62 0,61 0,62 0,59 0,61 0,62 0,00
H ình 17. Tính đồng hình di truyền giữa các dòng Râu M èo được phản ánh bởi phổ điện di các phân đoạn ADN được khuếch đại bằng các mồi RAPD là O PA-18 (a) và OPC-4 (b).
M HN| hn2 hn3 TH, t h2 PT. p t2 qn, m M * * ---- B I■ m pmặ ftầ * * b M H N | h n2 T H « T H , t h2 P T , P Tị q n,
g
B
* ** r —1 M Í t o * 1» + • t» ề 4 »*•'» ặttịlHập
aH ình 18. Tính đa hình biểu hiện qua phổ điện di RAPD-PCR các dò n g R âu Mèo khác nhau có ADN được khuech đại bằng các mồi OPA-5 (a) và OPC-18 (b).
M TH„ TH| HN| HN, HN3 PT, PT2 QN,
H ình 19. Tính đa hình biểu hiện qua phổ điện di RAPD-PCR các dòng Râu Mèo khác nhau có AD N được khuếch đại bằng các mồi OPA-3 (a) và OPC-IO (b).
3.4. ĐỂ XUẤT PHƯƠNG ÁN BẢO TỔN, CHỌN GIỐNG VÀ NHÂN GIỐNG CÂY RÀU MÈO
3.4.1. Đánh giá chung về hiện trạng
Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) là một trong những loài cày thuốc tương đối dễ trồng, dễ nhân giống và có nhu cầu sử dụng cao ở trong nước cũng như ở nhiều nước trên th ế giới. Việt Nam nước ta có điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng ... tỏ ra phù hợp để phát triển m ở rộng sản xuất loài cây thuốc này phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Trong quá trình điều tra thu thập mẫu, chúng tôi nhận thấy kỹ thuật trồng trọt loài cây thuốc này tương đối đơn giản; cây có thể mọc tốt ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trong cả nước từ Bắc vào Nam . Nhưng đến nay có thể nói, chúng ta chưa thực quan tâm quy hoạch việc m ở rộng sản xuất loài cây thuốc này theo hướng phục vụ thị trường xuất khẩu. Điều này biểu hiện rõ khi điều tra ở các tỉnh miền Bắc, chúng tôi không tìm thấy một cơ sở sản xuất nào tập trung nhân, trồng cây Râu Mèo. Hầu hết các địa điểm thu mẫu chỉ là các vườn trồng tự phát. Có lẽ, đây là một trong những nguyên nhân dẫn đến việc diện tích và địa điểm phân bô của loài cây thuốc này dường như bị thu hẹp so với các đợt điều tra trước đây. H iện tượng hàm lượng sinensetin biến động lớn giữa các dòng, trong khi cấu trúc di truyền của chúng dựa trên chỉ thị RAPD-PCR có sự tương đồng di truyền cao cho thấy các yêu tô môi trường như khí hậu, sinh thai, thô nhương, điều kiện trồng trọt, tuổi sinh lý của cây ... bên cạnh nhân tô di truyên, có thê co anh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh tổng hợp và tích lũy sinensetin ơ cây Râu Meo.
3.4.2. Đề x u ấ t p h ư ơ n g á n bảo tồ n , chọn giỏng, n h â n giỏng n h ằ m m ở rộng sàn
xuất cày Râu mèo
Để khai thác tiềm năng tự nhiên nhằm mở rộng sản xuất loài cây thuỏc Râu Meo. đặc biệt tại các địa phương ở m iền Bắc, phục vụ nhu cầu trong nước và đinh hướng xuất
khẩu; trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi có những để xuất sau cho việc bảo tồn, định hướng chọn, tạo giống nhằm mở rộng sản xuất cây Râu Mèo:
Cân sơm co phương an bao tôn cac dòng cây Râu Mèo hiên có song song với việc tiêp tục chọn lọc, cho di thực các dòng cây mới từ các địa phương khác nhau trong cả nước và từ nước ngoài (chẳng hạn như từ Indonesia) nhằm làm tăng tính đa dạng của nguồn gen so với hiện tại.
- Trong quá trình chọn lọc các dòng, giống cây thuốc, nên dựa trên tiêu chí về hàm lượng sinensetin bằng việc sử dụng các phương pháp chiết xuất và phân tích RP-HPLC được chúng tôi mỏ tả trong nghiên cứu này.
- Cần tiến hành các nghiên cứu có hệ thống nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của các yếu tố m ôi trường, bao gồm cả các điều kiện trồng trọt, đến năng suất và khả năng tích lũy sinensetin ở cây Râu Mèo. Trên cơ sở đó, xây dựng được quy trình nhân giống và trổng trọt m ột cách hệ thống có thể đưa vào áp dụng đại trà, và cần xem đây như m ột bước quan trọng nhằm tiêu chuẩn hóa quá trình sản xuất dược liệu.
- Sau khi chọn lọc được các dòng Râu Mèo có hàm lượng sinensetin và/hoặc có
hoạt tính sinh học cao, có thể áp dụng các phương pháp công nghệ sinh học,
như nuôi cấy m ô và tế bào thực vật theo một quy trình được chúng tôi phát triển
gần đây (D inh Doan Long và cs., 2006) vào việc nhân nhanh các dòng, giông
ưu việt và đưa vào sản xuất theo quy mô phù hợp với yêu cầu sử dụng.
- Sử dụng chỉ thị RA PD -PCR theo quy trình được chúng tôi phát triển trong nghiên cứu này trong việc kiểm tra sự khác biệt về mặt di truyền giữa các dòng/giống, từ đó lựa chọn ra các dòng/giống cần cho việc bảo tồn, chọn và nhân giỏng. Chì thị RA PD -PCR cũng có thể sử dụng trong việc giúp phàn biệt nhanh các dược liệu có nguồn gốc từ cây Râu M èo 0Orthosiphon stamineus Benth.) với các nguồn dược liệu từ m ột sô' loài cây khác dễ nhầm lẫn do sự giống nhau về mặt hình thái của chúng, chẳng hạn như loài Orthosiphon spiralis ... trong quá trình kiểm định chất lượng dược liệu.
Nếu những đề xuất trên đây được thực hiện, chúng tôi thấy rằng một mỏ hình tiêu chuẩn hóa quá trình sản xuất dược liệu bằng việc sử dụng một số phương pháp sinh học có thể thực hiện và phát huy hiệu quả ngay từ khâu sản xuất nguồn nguyên liệu ban đầu là chọn, tạo và nhân giống. Chiến lược này là phù hợp VỚI chủ trương từng bước hiện đai hóa nền y học cổ truyền trong nước, cũng như từng bước tiêu chuẩn hóa quá trình san xuất dược liệu theo yêu cầu ngày càng khắt khe của thị trường trong nước cũng như của nước ngoài.
Từ các kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận chính sau: 1. Đã thu thập được 10 dòng Râu mèo được trồng ở các địa phương khác nhau ờ
Việt Nam, gồm Hà nội (3 dòng), Thanh Hóa (3 dòng), Phú Thọ (3 dòng), và Q uảng Nam (1 dòng). Sự phân bố của các cây Râu mèo ở các khu vực này tỏ ra hẹp hơn so với m ột số báo cáo điều tra trước đây.
2. Kết quả phân tích chỉ thị RAPD-PCR cho thấy các dòng Râu Mèo hiện có ở một số địa phương tại m iền Bắc có tính đa dạng di truyền không cao. Hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng được thu từ cùng một địa phương dao động trong khoảng 0,00 — 0,19, chỉ có dòng Râu Mèo thu tại Quảng Nam có sự khác biệt rõ rệt về cấu trúc đi truyền với các dòng còn lại với hệ số khoảng cách di truyền dao động trong khoảng 0,59 — 0,62. Hiện tượng đồng hình di truyền cao của các dòng thu tại Hà Nội, Phú Thọ và Thanh Hóa có lẽ một phần là do diện tích phân bô hạn chế hiện tại của cây Râu Mèo, hơn nữa loài cây này chủ yếu được nhân giống vỏ tính, nên các dòng từ cùng một địa phương có cấu trúc di giống nhau có nhiều khả năng xuất xứ từ cùng nguồn gốc.
3. Kết quả phàn tích hàm lượng sinensetin bằng kỹ thuật RP-HPLC trong dược liệu có nguồn gốc từ các dòng Râu mèo thu thập trong nghiên cứu này có mức độ biến động khá lớn (dao động từ 0,002 đến 0,188%), và không tương quan chặt với khoảng cách di truyền được xác định bởi chỉ thị RAPD-PCR cho thấy có lẽ bên cạnh yếu tố di truyền (kiểu gen/giống), thì các yếu tố khác, như tuổi sinh lý của cây điều kiện m ôi trường, sinh thái và kỹ thuật trồng trọt có thể đã ảnh đến sự tích lũy của hợp chất sinensetin trong các dòng Râu mèo.
4. Các phương pháp RP-H PLC và RAPD-PCR có thể được sử dụng như các cóng cụ kết hợp trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền và khả năng sinh tổng hơp các hợp chất sinh học thứ cấp từ cây Râu Mèo phục vụ cho các mục đích bảo tổn. định hướng chọn, tạo, nhân giống khi có nhu cầu mở rộng sản xuất; đổng thời cũng có thể sử dụng trong công tác kiểm định và tiêu chuẩn hóa dược liệu.
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ4.1. KẾT LUẬN 4.1. KẾT LUẬN
Trên cơ sơ cac kêt qua nghiên cứu thu nhận được từ đề tài, chúng tôi xin có một sô đề nghị sau:
1. Đê nghị cho áp dụng (hoặc chuyển giao) quy trình kỹ thuật phân tích chỉ thị RAPD-PCR và RP-HPLC đã được đề tài thiết lập và phát triển trong các công tác bảo tồn, định hướng chọn, tạo và nhân giống cây Râu mèo ở Việt Nam trong tương lai.
2. Nên lựa chọn, nhân nhanh và đưa vào sản xuất dòng Râu Mèo TH„ (thu tại Thanh Hóa), là dòng có hàm lượng dược chất sinensetin cao hơn cả (0,188%) trong số các dòng được thu thập trong nghiên cứu này.
3. Nên lựa chọn và dị thực thêm các dòng/giống cây Râu mèo mới từ các địa phương khác nhau, hoặc từ nước ngoài để làm tăng sự đa dạng về vốn gen hiên có, đặc biệt chú ý lựa chọn các giống/dòng có hàm lượng cao của các hợp chất có hoạt tính sinh học (trong đó có sinensetin) và áp dụng biện pháp công nghệ tế bào thực vật trong việc nhân nhanh giống và phát triển sản xuất.
4. Việc phối hợp giữa các chỉ thị hóa học (HPLC) với các chỉ thị ADN (ví dụ: RA PD -PCR) và các phương pháp công nghệ tê bào thực vật có thể góp phần tiêu chuẩn hóa quá trình sản xuất nguồn nguyên liệu làm thuốc từ cây thuốc Râu mèo nói riêng và các loài thảo dược nói chung ở nước ta trong tương lai. Vì vậy,
