1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.2. Chỉ thị ADN và hóa học trong công tác kiểm định dược liệu
Trước đây, ngành dược liệu chủ yếu thực hiện kiểm tra chất lượng các nguồn dược liệu dựa trên các thông số hình thái học và cảm quan thông thường, như hình dạng, kích thước, màu sắc, kiểu hình tế bào, đặc tính bề mật mô, mùi, vị, .... Đôi khi, các kỹ thuật hiển vi cũng được sử dụng trong việc phân tích các dạng dược liệu đã sơ chế, như dạng bột, dạng đã sấy khô (W arude, 2003). Tuy vậy, các phương pháp so sánh này phần nào phụ thuộc vào cảm quan của người phân tích, hơn nữa có nhiều nguồn nguyên liệu bản chất khác nhau nhưng có các đặc điểm trên rất giống nhau, dễ gây nhầm lẫn trong quá trình phân tích. Với sự phát triển của các bộ môn khoa học có liên quan, đặc biệt thuộc các lĩnh vực hóa phân tích và sinh học phân tử. ngành khoa học dược liệu ngày này có tính liên ngành cao. N hững tiến bộ trong lĩnh vực hóa phân tích có thể kể đên gồm các phương pháp sắc ký và khối phổ ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc xác định về thành phần các hợp chất sinh học trong các nguồn dược liệu (Joshi et al.. 2004).
A I HOC QUỐC G I A N A N O '
Trong việc kiém định dược liệu bằng các chỉ thị hóa học, thì hai phương pháp sắc ký lớp m ỏng (TLC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC) được sử dụng phổ biến hơn cả nhờ ưu điểm là quá trình phân tích nhanh, đơn giản và có khả năng định lượng được nhiều hợp chất ở hàm lượng vết. Ngoài ra, m ột sô' phương pháp phân tích khác như các phương pháp đo thể tích, sắc ký khí, sắc ký cột, điện di mao quản và khối phổ đôi khi cũng được sử dụng trong các quy trình kiểm định các nguồn dược liệu (Joshi et al., 2004).
Tuy vậy, so với các chỉ thị ADN, việc sử dụng các chỉ thị hóa học trong công tác kiểm định dược liệu có m ột sô' hạn chế do thành phần hóa học của các nguồn nguvén liệu khác nhau thường rất biến động. Các nguồn nguyên liệu qua các quy trình chế biến khác nhau, thậm trí có cùng nguồn gốc xuất xứ nhưng khác nhau về hương vị, màu sắc và một số đặc tính hóa lý. Ngoài ra, các yếu tố môi trường khác, gồm cả các yếu tố môi trường bên ngoài (như điều kiện trồng trọt, bảo quản, sơ c h ế ,...) và các yếu tô' nội sinh (như kiểu gen, tuổi sinh lý ,...) cũng có thể ảnh hướng đến các thông số hóa lý và thành phần của dược liệu (W arude, 2003). Vì lý do này, gần đây, các chỉ thị ADN ngày càng được sử dụng rộng rãi hơn trong công tác kiểm định ở các loài cây thuốc. Đồng thời, kỹ thuật này cũng tỏ ra hiệu quả trong các nghiên cứu xác định nguồn nguyên liệu làm thuốc, định hướng cho các thí nghiệm phân tích. Các nhà khoa học Trung Quốc đã sử dụng các dấu chuẩn AD N trong nhiều trường hợp để xác định đặc trưng nguồn nguyên liệu từ các vị thuốc Bắc. Các dấu chuẩn RAPD-PCR cho thấy hiệu quả trong việc xác định nhanh các dược liệu có nguồn gốc từ các loài Ginseng (nhân sâm), Echinacea,
A tractylodes, Emblica officinalis và Tinospora cordifoìia (Patil, 2003), Lycium barbarum, Astragalus membanaceus (Fisch.) Bge., Ledebourielỉa seseloides Wolff,
Atractylodes m acrocephaỉa Koidz, Atractyỉodes (Cheng et al., 1998). Ngoài ra, kỹ thuật này cũng cho phép xác định được các dạng dược liệu giả hoặc dược liệu thay thế. Chẳng hạn như, kỹ thuật RA PD -PCR được dùng để phân biệt các loại dược liệu có nguồn gốc từ các loài C optis với loài P icrorrhiia (thường được dùng thay thế) trong y học cổ truyền Trung quốc (Cheng et al., 1997). Tương tự như vậy, chỉ thị ADN đã được dùng để phát hiện ra các dạng dược liệu thay thế và dược liệu giả ở các loài p. ginseng, p. quinque- folius (gọi là Sâm M ỹ), Echinacea (W olf et al., 1999).
Tuy vậy, để áp dụng được chỉ thị ADN trong công tác kiểm định dược liệu, cần thiết phải tiến hành phân tích ADN của các loài / giống có quan hệ gần gũi. dễ nhầm lẫn hoặc được dùng thay thế. Việc tách chiết được ADN có chất lượng tốt đảm bảo c h o quá trình phân tích ở các dược liệu đã qua chế biến đôi khi gặp khó khăn. Một vấn đề nữa là các chỉ thị ADN thường chỉ có thể giúp xác định được sự có m ặt của một kiểu gen (loài/giống) cây thuốc nào đó, nhưng không đảm bảo được sự có m ặt hay không của một thành phần hóa học nhất định. Vì vậy, trong công tác kiểm định dược liệu cần có sự két hợp của các chỉ thị AD N và các chỉ thị hóa học. Theo hướng nghiên cứu này. vài năm
qua đã có m ột số nhà nghiên cứu nỗ lực trong việc tìm kiếm các chỉ thị ADN có liên quan đến các biến dị về định tính và định lượng của các thành phần hóa học có trong các loài cây thuốc có quan hệ gần gũi (Cao et al, 1997). Việc kết hợp một cách hợp lý các kỹ thuật sinh học phân tử và hóa phân tích sẽ giúp phát triển m ột hệ thống kiểm định dược liệu một cách toàn diện và có thể ứng dụng trong các quy trình sản xuất công nghiệp.
1.2.3. Chỉ thị ADN trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc
Có lẽ ứng dụng phổ biến nhất của các chỉ thị ADN trong các nghiên cứu ở các loài thực vật đến này là nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền (thường được kết hợp với các chỉ thị hình thái). Việc xác định được tính đa dạng di truyền của các vốn gen ở thực vật có ý nghĩa quan trọng trong việc quy hoạch quản lý, bảo tồn nguồn gen và định hướng chọn, tạo giống. Các chỉ thị ADN dựa trên kỹ thuật RAPD-PCR đã được sử dụng trong các nghiên cứu đánh giá tính đa dạng di truyền ở các quần thể phân bố ở các vùng địa lý khác nhau ở nhiều loài cây thuốc khác nhau, như Taxus waỉlichiana (Shasany et al, 1999; Farooqui et al., 1998), .ĩuniperus communis L., Allium schoenoprasum L.,
Andrographis panicuỉata, Capsicum annuum (Hulya, 2003), Simmondsia chinensis L. Schneider (A m arger và M ercier, 1995), Vitis viniỊera L., Cam elìia sinesis, Podophyìlum peỉtatum, Podophyìhim hexandrum, Brassica campestris (Das et al., 1999).
Tương tự như vậy, mức độ đa dạng di truyền giữa m ột sô' loài được sử dụng làm thuốc thuộc các chi Glycerrhiza, Echinacea, Curcuma và A rabidopsis, Epimedium Scutellaria, Withania (Y am azaki, 1994; Kapteyn et al., 2002; Lind-H allden, 2002; Nakai et al., 1996) đã được xác định bằng việc sử dụng các kỹ thuật RAPD-PCR. Kỹ thuật này cũng đã được dùng để phân biệt ba dạng dưới loài M eìissa officinaỉis và các giống thuộc loài Hibiscus cannabinus L. (W olf et al, 1999).
Theo m ột hướng ứng dụng khác, các chỉ thị RA PD được kết hợp sử dụng trong việc xây dựng bản đồ di truyền ở các loài Eucalyptus grandis và Eucalyptus urophylla, Taxus braviỷolia Nutt. (G rattapaglia và Sederoff, 1994; Das et al, 1999).
1.2.4. Sử dụng các chỉ chị RAPD-PCR và hóa học trong chọn, tạo giông cây thuốc
Các chỉ thị ADN không chỉ có thể giúp xác định tính đa dạng di truyền hoặc phân biệt các loài và nguồn gốc của các nguồn dược liệu, m à trong nhiều trường hợp. chúng còn được dùng để dự đoán về khả năng tổng hợp và tích lũy các hợp chât có hoạt tinh sinh học ở các loài cây thuốc. Ở m ột số loài, người ta xác định được sự tương quan giữa một số chỉ thị A D N với các chỉ thị hóa học về m ặt định lượng. Đối với những loài cây này các chỉ thị A D N có thể được dùng để đánh giá chất lượng sản phẩm dược liệu từ
loài cây đó. Chẳng hạn như, ở Echinacea purpurea (Kapteyn et al, 2002), người ta có thể sử dụng m ột sô' chỉ thị A FL P trong việc dự đoán kiểu hình hóa học của các giống. Các chỉ thị RAPD-PCR cũng đã được tìm thấy tương quan với hàm lượng tinh dầu có tronơ ba giống khác nhau của loài Pelargonium graveolens và thành phần Aavonoid của các loài Aconitum (Shasany et al, 2002). Kiểu hình chỉ thị ADN cũng đã được dùng để xác định mối quan hệ di truyền giữa các kiểu hình hóa học khác nhau của loài Acorus calamus khi phân tích về thành phần tinh dầu (Joshi, 2004). Chỉ thị RAPD-PCR đã được dùng để phân biệt được các dòng cây Thanh hao hoa vàng {Artemisia annua L.) có hàm lượng dược chất chống sốt rét là artem isinin khác nhau. Nghiên cứu này đồng thời cho thấy sự đa dạng di truyền cao của các quần thể loài Thanh hao hoa vàng có ở Ấn Độ mặc dù chúng thường được trồng ở những vùng địa lý có đặc điểm sinh thái giống nhau, từ đó người ta định hướng được việc chọn, tạo giống làm tăng khả năng tổng hợp artemisinin. Kỹ thuật RAPD cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu về sự biến động khả nãng tổng hợp và tích lũy tinh dầu ở 12 giống thuộc loài Ocimum gratissium L. Ở loài này, người ta tìm thấy sự tương quan giữa m ột số chỉ thị RAPD với các chỉ thị hóa học khi phân tích tinh dầu và các hợp chất ílavonoid có hoạt tính sinh học (V iera et al, 2001). Ở loài
Hypericum perforatum, Steck và cs. (2002) đã xác định được dấu chuẩn RAPD-PCR có thể phân biệt nhanh các cá thể được hình thành theo con đường sinh sản hữu tính và với các cá thế sinh sản đơn tính, ở Tỏi, người ta cũng đã sử dụng RAPD-PCR như một công cụ để chọn ra các dòng Tỏi hữu thụ phục vụ cho các chương trình chọn giống (Etoh và Hong, 1996) Tương tự như vậy, ở loài Piper longum, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng trong việc chọn ra các cây phục vụ cho công tác bảo tồn và chọn, tạo giống (Parani et al.,
1997).
1.3. CÁC NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u CỦA ĐỂ TÀI
Mặc dù đã có những nghiên cứu khẳng định về giá trị y-sinh học từ các chế phẩm của cây Râu m èo (Orthosiphon stamineus Benth.) như đã nêu ở phần 1.1, việc phát triển loài cây thuốc này ở nước ta còn rất hạn chế, cụ thể chủ yếu loài cây này chỉ được trồng tự phát tại một sô nơi. Trong các nguyên nhân gây nên hiện tượng này là do thiêu các nghiên cứu cơ bản nhằm định hướng bảo tồn, chọn lọc và nhân giống phát triển loài cây thuốc này.
Vì vậy để xác định được mức độ đa dạng di truyền và khả năng sinh tổng hợp sinensetin của m ột số quần thể cây thuốc Orthosiphon stamineus hiện có ờ Việt Nam làm cơ sở cho việc định hướng bảo tồn và chọn, tạo giống loài cây thuốc quý này ớ nước ta trong tương lai. chúng tôi đã lưa chon và tiên hanh đê tai Đoỉĩh giũ tinh dơ dợntt di
truyền n h ờ c h ỉ th ị p h â n tử RAPD-PCR và khả năng sinh tổng hợp sinensetin ở loài cây thuốc Orthosiphon stamineus Benth. ”, với m ột số nội dung nghiên cứu như sau:
1) Điều tra và thu thập m ẫu thực vật từ các quần thể Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) có ở các địa phương khác nhau ở Việt nam dùng cho các nghiên cứu phân tích về chỉ thị ADN và thành phần sinensetin.
2) Nghiên cứu hoàn thiện phương pháp tách chiết ADN của loài cây thuốc này. Phân tích tính đa hình ADN giữa các quần thể dựa trên dấu chuẩn RAPD-PCR.
3) Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết xuất và phân tích sinesetine từ loài
Orthosiphon stamineus Benth. bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
4) Xác định mức độ khác biệt (đa dạng) về m ật di truyền và thành phần sinensetin giữa các m ẫu quần thể Orthosiphon stamineus Benth. hiện có ở Việt nam nhằm đề xuất phương án bảo tồn, chọn tạo giống và phát triển loài cây thuốc này ở Việt nam trong tương lai.
2. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM v à p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u
2.1. THỜI GIAN NGHIÊN c ứ u
Từ tháng 8 năm 2005 đến tháng 10 năm 2006.
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN c ứ u
Vicc đieu tra va thu thập cãc mâu thực vật loai cây thuốc O rth o sip h o n stoiĩĩincns
Benth. được tiến hành trên các địa phương khác nhau ở Việt Nam, gồm Hà Nội Cao Bằng, Thanh Hoá, H à Tây, Q uảng Nam, ...
Các nghiên cứu xác định mẫu thuộc loài Orthosiphon stamineus Benth. được tiến hành tại Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), các nghiên cứu phân tích chỉ thị phân tử RA PD -PCR từ các mẫu quần thể thu được và chiết xuất sinensetin được tiến hành tại Trung tâm Sinh học phân tử và Công nghệ T ế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà nội). N ghiên cứu phân tích thành phần sinensetin bằng kỹ thuật HPLC được thực hiện tại Khoa Phân tích tiêu chuẩn, Viện Dược liệu (Bộ Y tế).
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.3.1. Chuẩn bị mẫu thực vật
Các vật liệu thực vật gồm thân và lá (gọi chung là dược liệu) của các cây một nãm tuổi thuộc 10 dòng Râu m èo được thu thập từ các địa phương khác nhau ớ Miền Bắc Việt Nam (như trình bày trên Bảng 1) được sử dụng làm nguồn nguyên liệu đê chiết xuất và phân tích sinensetin. Dược liệu sau khi thu hái được chuyển về phòng thí nghiệm trong thời gian từ tháng 10/2004 đến tháng 6/2005, được phân loại riêng rẽ thành các phần thân và lá, loại bỏ những phần giập nát hoặc có biểu hiện nhiễm vi sinh vật, rửa cho sạch bụi bẩn rồi được sấy khô trong tủ sấy mẫu Memmert® ở nhiệt độ 4 0 °c có quạt thông gió cho đến khô (thời gian sấy khoảng 1 tuần). Các mẫu thực vật đã được sấy khô sau đó được nghiền và rây thành các hạt có đường kính dưới 1 mm, bảo quản trong tủ hút ẩm cho đến khi sử dụng cho quá trình chiết xuất và phân tích sinensetin.
Để sử dụng cho các thí nghiệm phân tích chỉ thị RAPD-PCR, các phần mô lá của các cây có biểu hiện sạch bệnh phát triển tốt được tách ra từ cây mẹ, rồi sử dụng dao mổ có lưỡi dao tiệt trùng cắt bỏ các phần mô có biểu hiện tổn thương hoặc chét rỏi được nghiền trong nitơ lỏng thành các hạt nhỏ đều, bảo quản ở -8 0 °c cho đên khi được dùng để cho các thí nghiệm tách chiết và phân tích ADN.
Bảng 1. Danh sách và địa điểm các dòng Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) được thu thập và sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên (ký hiệu) Nơi thu thâp mẫu
các dòng Xã (Phường), Q uận (Huyên) Tỉnh (Thành phố)
1 HN, Ngũ Hiệp, Thanh Trì
2 h n2 Ngũ Hiệp, Thanh Trì Hà Nội
3 h n3 Ngũ Hiệp, Thanh Trì
4 THo Hà Trung
5 TH, Thành phố Thanh Hóa Thanh Hóa
6 t h2 Thành phố Thanh Hóa
7 PT, Thành phố Việt Trì
8 p t2 Thành phố Việt Trì Phú Thọ
9 p t3 Thành phố Việt Trì
10 QN, Huyện Trà My Quảng Nam
2.3.2. Các hợp chất sử dụng trong nghiên cứu
Hợp chất chuẩn sinensetin được mua từ hãng hóa chất Extrasynthese (Lyon, Pháp). Các hợp chất sử dụng trong các thí nghiệm phân tích RAPD-PCR được nhập từ hãng Sigma-Aldrich (St. Louis, M ỹ) hoặc M erck & Co. Ltd (Darm stadt, Đức). Enzym Tuq ADN polym erase được cung cấp bởi Trung tâm Sinh học phân tử và Công nghệ tế bào, Trường Đại học K hoa học Tự nhiên (ĐHQGHN). Các mồi RAPD-PCR được mua từ hãng Fermentas (Lithuania). Các hóa chất khác được sử dụng trong phân tích sắc ký lỏng cao áp (RP-HPLC) được cung cấp bởi hãng M erck & Co. Ltd (Darmstadt, Đức). Tất cả các hóa chất đều đạt chuẩn HPLC hoặc độ tinh khiết phân tích.
2.3.3. Chiết xuất và phân tích thành phần sinensetin bằng kỹ thuật RP-HPLC
Sinensetin được chiết xuất theo phương pháp chiết xuất flavonoids tổng số và phán tích bằng kỹ thuật RP-H PLC theo quy trình đã được Loon và công sự mô tả trước đây (2005) với một số cải tiến kỹ thuật cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Các quy trình chiết xuất và phàn tích sinensetin được mô tả rút gọn trên Hình 8 và 9.
Trước tiên, để chiết xuất Aavonoid tổng số, 1 g dược liệu từ mỗi dòng được cho vào bình cầu dung tích 250 ml. Chiết soxhlet với n-Hexan tới khi dịch chiết hết màu. Bỏ dịch chiết n-hexan. Sau đó, dược liệu được tiếp tục chiêt với côn 80° tới khi hêt mau vang (trong khoảng 6 giờ). Cô dịch chiết cồn với áp suất giảm bằng máy cỏ quay chăn khỏng. Hòa tan cắn trong nước. Chiết flavonoid tổng số bằng cách lắc với ethylacetat cho tới hét màu vàng. Cô dịch chiết cồn với áp suất giảm một lần nữa, rồi hòa tan cắn thu được hãng
methanol. Lọc dich chiêt qua giây lọc vào bình đinh mức 5 ml. Thêm dung môi tới vạch
để thu được dịch chiết 200 m g /m l rồi lọc dịch chiết qua màng lọc Supelco (13m m X 0,45
|im) trước khi dùng cho quá trình phân tích HPLC.
Cây (1 năm tuổi)
Sấy ở 40"C trong điều kiện thoáng
ị khí (tủ sấy Memmert) cho đến khô
Dươc liêu khô• •
Chiết Sohlet Ig dược liệu khô với
ị n-Hexan tới khi dịch chiết hết màu
Dịch chiết n-Hexan
ị Cô quay đ ể loại n-Hexan
Sản phẩm chiết bằng n-Hexan
I Chiết với EtOH 80%
ị cho đến hết màu vàng