Thời gian, địa điểm và phương pháp nghiên cứu

2.1. THỜI GIAN NGHIÊN c ứ u

Từ tháng 8 năm 2005 đến tháng 10 năm 2006.

2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN c ứ u

Vicc đieu tra va thu thập cãc mâu thực vật loai cây thuốc O rth o sip h o n stoiĩĩincns

Benth. được tiến hành trên các địa phương khác nhau ở Việt Nam, gồm Hà Nội Cao Bằng, Thanh Hoá, H à Tây, Q uảng Nam, ...

Các nghiên cứu xác định mẫu thuộc loài Orthosiphon stamineus Benth. được tiến hành tại Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), các nghiên cứu phân tích chỉ thị phân tử RA PD -PCR từ các mẫu quần thể thu được và chiết xuất sinensetin được tiến hành tại Trung tâm Sinh học phân tử và Công nghệ T ế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà nội). N ghiên cứu phân tích thành phần sinensetin bằng kỹ thuật HPLC được thực hiện tại Khoa Phân tích tiêu chuẩn, Viện Dược liệu (Bộ Y tế).

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.3.1. Chuẩn bị mẫu thực vật

Các vật liệu thực vật gồm thân và lá (gọi chung là dược liệu) của các cây một nãm tuổi thuộc 10 dòng Râu m èo được thu thập từ các địa phương khác nhau ớ Miền Bắc Việt Nam (như trình bày trên Bảng 1) được sử dụng làm nguồn nguyên liệu đê chiết xuất và phân tích sinensetin. Dược liệu sau khi thu hái được chuyển về phòng thí nghiệm trong thời gian từ tháng 10/2004 đến tháng 6/2005, được phân loại riêng rẽ thành các phần thân và lá, loại bỏ những phần giập nát hoặc có biểu hiện nhiễm vi sinh vật, rửa cho sạch bụi bẩn rồi được sấy khô trong tủ sấy mẫu Memmert® ở nhiệt độ 4 0 °c có quạt thông gió cho đến khô (thời gian sấy khoảng 1 tuần). Các mẫu thực vật đã được sấy khô sau đó được nghiền và rây thành các hạt có đường kính dưới 1 mm, bảo quản trong tủ hút ẩm cho đến khi sử dụng cho quá trình chiết xuất và phân tích sinensetin.

Để sử dụng cho các thí nghiệm phân tích chỉ thị RAPD-PCR, các phần mô lá của các cây có biểu hiện sạch bệnh phát triển tốt được tách ra từ cây mẹ, rồi sử dụng dao mổ có lưỡi dao tiệt trùng cắt bỏ các phần mô có biểu hiện tổn thương hoặc chét rỏi được nghiền trong nitơ lỏng thành các hạt nhỏ đều, bảo quản ở -8 0 °c cho đên khi được dùng để cho các thí nghiệm tách chiết và phân tích ADN.

Bảng 1.

STT ^{Tên (ký hiệu) Nơi thu thâp mẫu}

các dòng Xã (Phường), Q uận (Huyên) _{Tỉnh (Thành phố)}

1 _{HN, Ngũ Hiệp, Thanh Trì}

2 h n2 Ngũ Hiệp, Thanh Trì _{Hà Nội}

3 _{h n3 Ngũ Hiệp, Thanh Trì}

4 _{THo Hà Trung}

5 _{TH, Thành phố Thanh Hóa Thanh Hóa}

6 _{t h2 Thành phố Thanh Hóa}

7 _{PT, Thành phố Việt Trì}

8 _{p t2 Thành phố Việt Trì Phú Thọ}

9 _{p t3 Thành phố Việt Trì}

10 _{QN, Huyện Trà My Quảng Nam}

2.3.2. Các hợp chất sử dụng trong nghiên cứu

Hợp chất chuẩn sinensetin được mua từ hãng hóa chất Extrasynthese (Lyon, Pháp). Các hợp chất sử dụng trong các thí nghiệm phân tích RAPD-PCR được nhập từ hãng Sigma-Aldrich (St. Louis, M ỹ) hoặc M erck & Co. Ltd (Darm stadt, Đức). Enzym Tuq ADN polym erase được cung cấp bởi Trung tâm Sinh học phân tử và Công nghệ tế bào, Trường Đại học K hoa học Tự nhiên (ĐHQGHN). Các mồi RAPD-PCR được mua từ hãng Fermentas (Lithuania). Các hóa chất khác được sử dụng trong phân tích sắc ký lỏng cao áp (RP-HPLC) được cung cấp bởi hãng M erck & Co. Ltd (Darmstadt, Đức). Tất cả các hóa chất đều đạt chuẩn HPLC hoặc độ tinh khiết phân tích.

2.3.3. Chiết xuất và phân tích thành phần sinensetin bằng kỹ thuật RP-HPLC

Sinensetin được chiết xuất theo phương pháp chiết xuất flavonoids tổng số và phán tích bằng kỹ thuật RP-H PLC theo quy trình đã được Loon và công sự mô tả trước đây (2005) với một số cải tiến kỹ thuật cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Các quy trình chiết xuất và phàn tích sinensetin được mô tả rút gọn trên Hình 8 và 9.

Trước tiên, để chiết xuất Aavonoid tổng số, 1 g dược liệu từ mỗi dòng được cho vào bình cầu dung tích 250 ml. Chiết soxhlet với n-Hexan tới khi dịch chiết hết màu. Bỏ dịch chiết n-hexan. Sau đó, dược liệu được tiếp tục chiêt với côn 80° tới khi hêt mau vang (trong khoảng 6 giờ). Cô dịch chiết cồn với áp suất giảm bằng máy cỏ quay chăn khỏng. Hòa tan cắn trong nước. Chiết flavonoid tổng số bằng cách lắc với ethylacetat cho tới hét màu vàng. Cô dịch chiết cồn với áp suất giảm một lần nữa, rồi hòa tan cắn thu được hãng

methanol. Lọc dich chiêt qua giây lọc vào bình đinh mức 5 ml. Thêm dung môi tới vạch

để thu được dịch chiết 200 m g /m l rồi lọc dịch chiết qua màng lọc Supelco (13m m X 0,45

|im) trước khi dùng cho quá trình phân tích HPLC.

Cây

(1 năm tuổi)

Sấy ở 40"C trong điều kiện thoáng

ị khí (tủ sấy Memmert) cho đến khô

Dươc liêu khô

Chiết Sohlet Ig dược liệu khô với

ị n-Hexan tới khi dịch chiết hết màu

Dịch chiết n-Hexan

ị Cô quay đ ể loại n-Hexan

Sản phẩm chiết bằng n-Hexan

I Chiết với EtOH 80%

ị cho đến hết màu vàng

ị

Sản phẩm chiết bằng EtOH

ị Hòa tan trong H:0

Dung dịch chiết xuất trong H20

ị Chiết với EthylA cetate

Dịch chiết Flavonoids

ị Cô quay đ ể loại dung môi

Sản phẩm chiết chứa Flavonoids cô đặc

H òa tan trong M eOH, lọc qua g iấ y lọc

Whalmann, bổ sung MeOH tới 5mỉ

▼

Dich chiết chứa Flavonoids hòa tan trong MeOH

(dịch chiết dược liệu khô 200mg/ml)

H ìn h 8. Q uy trình chiết xuất ílavonoid tổng số từ cây Râu mèo

Tách chiết A D N tổn g số: Các mô lá sau khi được nghiền trong nitơ lỏng đươc chiết xuất ADN theo qui trình của Gabriel và cộng sự (1997) với m ột sô' cải tiến nhỏ cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng sô' trong dịch tách chiết được xác định trên bằng phương pháp quang phổ ở các bước sóng 260 và 280 nm, và điện di trên gel agarose.

Phản ứng khuếch đại A D N bằng PCR: Các phản ứng RAPD-PCR được tiến hành trong hỗn hợp phản ứng có thể tích 25 |il, gồm 75 r|g ADN mẫu (làm khuôn), 2,5 |il đung dịch đệm, 250 T|g mồi RAPD, 400 I^mol dNTPs và 3,5 đơn vị Taq ADN polymerase. Phản ứng được thực hiện trong máy luân nhiệt Perkin - Elmer 9600 (Biosystem) qua 45 chu kỳ gồm các giai đoạn: 1) biến tính: 94"C trong 60 giây, 2) gắn mồi: 37 - 40oC (tùy m ồi) trong 30 giây, 3) kéo dài chuỗi trùng hợp: 72°c trong 60 giây. Sau giai đoạn khuếch đại 45 chu kỳ, phản ứng được giữ ở 7 2 °c trong vòng 7 phút rồi chuyển về 4°c nhằm bảo quản mẫu. Các mồi được sử dụng trong các phản ứng RAPD- PCR gồm có trình tự 10 nucleotit ngẫu nhiên khác nhau (như được trình bày trên Bảng 2), gồm OPA-3, -4, -5, -6, -10, -14, -18; OPC-4, -10, -13, -15 và -18.

Phương ph áp điện di: Các sản phẩm ADN khuếch đại được phân tích trên gel đ iệ n di agarose 1,0 %, sau khi được nhuộm bằng ethidium bromide. Phổ điện di các phân đoạn ADN của các m ẫu cây khác nhau được khuếch đại bởi cùng một mồi được đem ra so sánh để đánh giá mức độ khác biệt (đa dạng) về m ặt di truyền giữa chúng.

2.3.4. Các thí nghiệm phân tích chỉ thị RAPD-PCR

Bảng

STT Ký hiệu mồi Trình tự nucleotit TA m MW

1 OPA-3 5’ - AGTCAGCCAC - 3’ 36,5 2996 2 OPA-4 5’ - AATCGGGCTG - 3’ 48,0 3068 3 OPA-5 5’ - AGGGGTCTTG - 3’ 40.9 3098 4 OPA-6 5’ - GGTCCCTGAC - 3’ ^{40,4 3004} 5 OPA-IO 5’ - GTGACGTAGG - 3’ 39,6 3068 6 OPA-14 5’ - TCTGTGCTGG - 3' ^{40.3 3050} 7 OPA-18 5' - AGGTGACCGT - 3’ ^{41.0 3068} 8 OPC-4 5' - CCGCATCTAC - 3’ ^{39.1 3084} 9 OPC-IO 5' - TGTCTGGGTG - 3' ^{39.3 3090} 10 OPC-13 5' - AAGCCTCGTC - 3’ ^{41.6 2 9 8 8} 11 OPC-15 5' - GACGGATCAG - 3' ^{37,4 3077} 12 _OPC-18 5' - TGAGTGGGTG - 3’ 39.6 3138

Phương p h á p ph ân tích s ố liệu: Các băng ADN được xác định từ kết quả chạy điện di sản phẩm PCR với các m ồi ngẫu nhiên và được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng m ặt của chúng. Các số liệu trên được đưa vào chương trình NTSYSpc 2.02h (Applied Biostatistics Inc.) để phân tích và đánh giá mức độ tương đồng giữa các cặp mẫu nghiên cứu. Hệ số tương đồng do phần mềm tính toán dựa trên ma trận nhị phân (trong đó “ 1” tương ứng với sự có m ặt của một phân đoạn ADN, còn “0” là vắng mặt một phân đoạn A DN) theo công thức toán học của Nei và Li (1979; xem Rolhf. 1993):

2Nxy

s = ---

Nx + Ny

Trong đó:

Nxy là số băng AD N chung của hai mẫu X, y. Nx là số băng ADN của mẫu X.