40 .3 1 26 95 .5 8 23 59 .5 8 21 65 .8 2 19 70 .8 9 17 07 .5 7 16 55 .5 8 14 69 .6 3 14 13 .5 2 13 60 .7 9 13 44 .2 8 12 81 .8 2 12 42 .0 2 11 49 .2 2 11 11 .9 3 10 59 .0 7 96 1. 17 84 1. 70 52 8. 42 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Wavenumber cm-1 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 T ra n sm itt a n ce [ % ] Page 1/1
D:\KETQUA10\P49\110910\SV.0 G3-MPEG-5-FU SOLID 2010/11/09
34 32 .2 9 28 88 .8 0 19 79 .9 8 16 59 .9 7 14 69 .5 9 13 44 .7 0 12 81 .9 1 12 43 .6 1 11 48 .8 2 11 12 .9 0 10 59 .3 9 96 0. 82 84 1. 82 63 9. 43 54 9. 68 52 9. 08 46 7. 18 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Wavenumber cm-1 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 T ra n sm itt a n ce [ % ] Page 1/1
Hình 27 Phổ IR của 5-FU (A), PAMAM G3.0-MPEG (B), PAMAM G3.0-MPEG- 5-FU (C)
Phổ 1H-NMR (phụ lục 2, 6)
C=O của PAMAM G3.0-MPEG
C=O của 5-FU
C B
A
B
Hình 28 Phổ 1H NMR của PAMAM G3.0-MPEG (A) và PAMAM G3.0–MPEG-5- FU (B) Ảnh TEM (Phụ lục 8, 9) MPEG OCH3 Ha MPEG OCH3 PAMAM MPEG PAMAM 5-FU
Hình 29 Ảnh TEM của 5-FU nang hóa trong PAMAM G3.0-MPEG Bàn luận
- So sánh với phổ IR của 5-FU và chất mang PAMAM G3.0-MPEG, phổ của sản phẩm gắn thuốc PAMAM G3.0-MPEG-5-FU có các vị trí và hình dạng peak rất giống với phổ của chất mang PAMAM G3.0-MPEG, điểm khác biệt chính là hai peak 1709 và 1654 cm-1 của các liên kết C=O của PAMAM G3.0-MPEG đã bị che bởi vùng peak tại vị trí 1659 cm-1 đặc trưng cho các liên kết C=O của 5-FU.
- Tiếp tục so sánh phổ 1H-NMR, ta cũng thấy phổ của sản phẩm gắn thuốc PAMAM G3.0-MPEG-5-FU có các vị trí và hình dạng peak rất giống phổ chất mang PAMAM G3.0-MPEG. Điểm khác biệt quan trọng cũng là sự xuất hiện mũi đôi tại 7,31-7,62 ppm đặc trưng cho proton của 5-FU.
- Do phổ IR và 1H-NMR của PAMAM G3.0-MPEG-5-FU chỉ là sự kết hợp đơn thuần của phổ 5-FU và chất mang PAMAM G3.0-MPEG, không có sự xuất hiện peak mới hay dịch chuyển vị trí peak. Hơn nữa, khi tiến hành phóng thích toàn bộ thuốc 5-FU đã được nang hóa bên trong cấu trúc PAMAM G3.0-MPEG ra ngoài, ta thu được chất mang PAMAM G3.0-MPEG có cấu trúc không thay đổi so với ban đầu (phổ 1H-NMR không thay đổi - phụ lục 10) nên có thể rút ra kết luận là 5-FU chỉ được bao bọc trực tiếp bên trong cấu trúc PAMAM G3.0-MPEG. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trước đây trên thế giới.
- Với ảnh TEM của PAMAM G3.0-MPEG-5-FU, quan sát thấy có các cấu trúc thuốc hình cầu có kích thước khoảng 5-10 nm nằm bên trong cấu trúc PAMAM G3.0-
KẾT LUẬN
Đã nang hóa được 5-FU bên trong cấu trúc chất mang PAMAM G3.0-MPEG. Lượng 5-FU nang hóa trong cấu trúc PAMAM được tính toán gián tiếp thông qua nồng độ 5-FU tự do không nang hóa, xác định bằng phương pháp đo độ hấp thu A ở bước sóng 265,5 nm.
Từ phương trình đường chuẩn (C5-FU =0,7-15,0µg/ml): A265,5 =0,0559.C5-FU + 0,0052 (Phụ lục 11), tính toán được kết quả: 1 g chất mang PAMAM G3.0-MPEG mang được 0,067 g thuốc 5-FU (1 phân tử chất mang mang được 29,5 phân tử 5-FU).
4.4 Khảo sát nhả thuốc in vitro trong môi trường nước
Từ giá trị A265,5 và dựa vào phương trình đường chuẩn A265,5 theo C5-FU, tính được nồng độ 5-FU khuếch tán ra khỏi chất mang và đi ra bên ngoài túi thẩm tách. Phần trăm 5-FU được nhả ra khỏi chất mang được tính theo công thức:
% 5-FU = 100% 5 5 x C C FUo FU − −
C5-FU: nồng độ 5-FU ở thời điểm t
C5-FUo: nồng độ 5-FU nếu 5-FU được giải phóng hết ra khỏi chất mang C5-FUo = 1010 1000 0164 , 0 x = 16,263(µg/ml)
Bảng 4 Khảo sát nhả thuốc in vitro trong môi trường nước
Thời gian A265,5 Nồng độ 5-FU (µg/ml) % 5-FU nhả ra
1h 0,371 6,546 40,25
2h 0,543 9,721 59,78
3h 0,618 11,189 68,80
4h 0,662 12,113 74,48
6h 0,69 12,886 79,24 24h 0,694 13,225 81,32 48h 0,715 13,766 84,64 3 ngày 0,703 13,670 84,05 4 ngày 0,69 13,550 83,32 5 ngày 0,702 13,927 85,64 6 ngày 0,68 13,624 83,77 21 ngày 0,652 13,731 84,43
Hình 30 Phần trăm lượng thuốc phóng thích theo thời gian
Ở đây, nhận thấy lượng 5-FU nang hóa trong cấu trúc PAMAM G3.0-MPEG được phóng thích ra đến 79% chỉ trong 6 giờ. Nhưng sau đó, tốc độ phóng thích thuốc giảm và chỉ 6% được phóng thích trong 4 ngày tiếp theo. Và còn khoảng 16% lượng thuốc vẫn tiếp tục được nang hóa trong cấu trúc của PAMAM (sau 3 tuần). Kết quả thử nghiệm khảo sát phụ thuộc nhiều yếu tố như tỉ lệ thể tích nước thẩm tách bên
ngoài so với thể tích mẫu bên trong túi, nồng độ thuốc được khảo sát, số lần lấy mẫu và lượng mẫu được lấy mỗi lần, cũng như tốc độ khuấy trong quá trình thẩm tách… Cũng như cần phải xét đến ảnh hưởng của môi trường máu, dịch cơ thể và môi trường nội bào chứa nhiều tác nhân enzyme và nhiều thành phần khác có thể thúc đẩy hay kiềm hãm quá trình phóng thích thuốc. Do đó kết quả khảo sát in vitro ở đây chỉ mang tính tương đối, chưa phản ánh được khả năng mang và nhả thuốc thực sự của chất mang PAMAM G3.0-MPEG trong cơ thể.
4.5 Kết quả thử nghiệm hiệu quả in vivo của 5-fluorouracil nang hóa trong PAMAM G3.0-MPEG trên chuột mang khối u vú của người
Kết quả tạo khối u trên chuột
Trên tổng số 35 chuột tiến hành gây tạo khối u, thu được 20 chuột có khối u ổn định trong 10 ngày phù hợp cho thí nghiệm tiếp theo. Các tế bào từ khối u cho kết quả dương tính khi đánh giá bằng kháng thể kháng HLA, chứng tỏ các tế bào trong khối u là tế bào ung thư người MCF7 (95,59% tế bào dương tính HLA).
Hình 31 Kết quả phân tích khối u bằng phương pháp Flow cytometry với kháng thể kháng HLA.
(A).Tế bào ung thư vú người;
(B).Kết quả phân tích HLA trên khối u của chuột.
Hình 32 Chuột mang khối u tế bào ung thư người MCF7 Kết quả thử nghiệm in vivo
Số liệu:
Số liệu kết quả giảm thể tích khối u ở các lô thí nghiệm được trình bày ở phụ lục 12. Trong đó, phần trăm giảm thể tích khối u được tính bằng công thức:
% 100 0 0 x V V V N N N −
Với: VN0: Thể tích khối u ngày bắt đầu điều trị (ngày 0) VN: Thể tích khối u ngày thứ n (ngày 15)
Bảng 5 Trung bình phần trăm giảm thể tích khối u ở các lô thí nghiệm theo thời gian
Ngày 0 Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15
5-FU nang hóa trong chất mang 0,00 33,72 ±8,79 48,36 ± 5,41 85,37±80,6 5-FU 0,00 24,80±19,51 18,47±8,97 23,69±13,78 Đối Chứng 0,00 -11,53±7,69 -18,04±14,20 9,64±24,95
Hình 33 Biểu đồ so sánh phần trăm giảm thể tích khối u ở các lô thí nghiệm
a b
Hình 34 Chuột mang khối u vào ngày 0 (a) và sau 15 ngày điều trị bằng thuốc (b)
Bàn luận:
Về nguyên tắc, khi sử dụng chuột bị gây ức chế miễn dịch bằng thuốc thì hệ miễn dịch của chuột không bị suy giảm tuyệt đối. Do đó, chuột vẫn có khả năng thải loại tế bào ung thư được ghép vào. Khả năng thải loại mạnh hay yếu phụ thuộc vào sinh lý của từng con chuột. Vì vậy, kích thước ban đầu của các khối u trong từng lô thí nghiệm có sự chênh lệch lớn. Do đó để đánh giá chính xác, hiệu quả điều trị được căn cứ trên phần trăm thể tích giảm/tăng so với kích thước khối u ban đầu. Khi so sánh phần trăm giảm thể tích thì các sai số do kích thước khối u ban đầu sẽ được loại bỏ
5-FU trong chất mang
5-FU Đối chứng
Vấn đề thứ hai là cùng một điều kiện tác động nhưng do sinh lý, thể trạng của các con chuột khác nhau nên đáp ứng khác nhau. Điều này dẫn đến sự tăng giảm thể tích khối u không nhất quán trong từng lô khảo sát. Có con chuột tăng kích thước khối u, có con chuột bị giảm kích thước khối u trong cùng một lô. Do đó cần đánh giá hiệu quả căn cứ trên trung bình phần trăm giảm thể tích khối u của các lô chuột thử nghiệm.
Xét về trung bình phần trăm giảm thể tích khối u (bảng và hình ) thì lô thuốc 5-FU nang hóa trong PAMAM G3.0-MPEG cho hiệu quả điều trị tốt nhất, thể tích khối giảm đều theo thời gian, phần trăm giảm cực đại ở ngày thứ 15 là 85,37%. Còn đối với lô 5-FU tự do, sau 5 ngày điều trị thể tích khối u không giảm mà có xu hướng tăng kích thước hơn so với ngày 0, tuy nhiên từ ngày 5 đến ngày 15 thể tích khối u lại giảm và phần trăm giảm cực đại là 23,69% vào ngày thứ 15. Lô đối chứng có thể tích khối u tăng đều từ ngày 0 đến ngày 10 và giảm nhẹ vào ngày 15 (9,64%).
Tuy nhiên, nếu xem xét đến tỉ lệ tử vong thì lô thuốc 5-FU nang hóa trong PAMAM G3.0-MPEG có tỉ lệ tử vong cao hơn so với các lô còn lại (2/9 chuột tử vong). Các lô còn lại không có chuột chết. Chuột chết có thể do hai nguyên nhân:
Bị tác động của thuốc gây suy giảm miễn dịch và đáp ứng với khối u. Bị tác động của thuốc thử nghiệm.
5-Fluorouracil là một thuốc chống ung thư có độc tính nhưng lại nhanh chóng được thải trừ ra khỏi tuần hoàn và cơ thể. Khi nang hóa trong chất mang, thuốc 5-FU được phóng thích từ từ vào tuần hoàn, thời gian lưu của thuốc 5-FU trong tuần hoàn tăng lên, làm tăng hiệu quả điều trị, nhưng bên cạnh đó cũng có thể làm kéo dài tác dụng của độc tính. Nhưng do trong quá trình khảo sát cũng có chuột chết từ giai đoạn rất sớm, trước khi tiêm thuốc, nên không thể kết luận được chuột chết là do tác động của thuốc 5-FU thử nghiệm.
Kết luận:
Ở cùng một liều điều trị 10 mg/kg/ngày, thuốc 5-FU nang hóa trong PAMAM G3.0- MPEG sơ bộ cho hiệu quả điều trị tốt hơn so với thuốc 5-FU tự do không nang hóa, tuy nhiên lại có biểu hiện tăng độc tính. Do đó đang tiến hành thử nghiệm ở các liều điều trị thấp hơn.
Chương 5 KẾT LUẬN
So với mục tiêu đặt ra của đề tài, đã đạt được:
− Tổng hợp polymer PAMAM lai hóa MPEG 5000
− Tổng hợp phức hợp thuốc PAMAM G3.0-MPEG-5 FU, hàm lượng thuốc là 0,063g 5-FU/g thuốc, tương ứng 1 phân tử chất mang mang được 29,5 phân tử 5-FU.
− Thuốc được nhả chậm đến 4 ngày trong điều kiện khảo sát nhả thuốc in vitro.
− Kết quả thử nghiệm hiệu quả in vivo chống ung thư vú trên chuột tại một liều điều trị 10 mg/kg/ngày
− Hiện nay đang tiếp tục tiến hành thử nghiệm hiệu quả in vivo tại các liều điều trị thấp hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
(1) Trần Thị Thu Hằng (2007), Dược lực học, Nhà xuất bản Phương Đông, 1-50 (2) Đỗ Như Quỳnh, Tổng hợp polyamidoamine lai hóa với polyethylene glycol,
2010
(3) Dược thư quốc gia Việt Nam, Hà Nội, 2006.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
(4) B. Arica, S. Calis, H. S. Kas, M. F. Sargon, A. A. Hincal, 5-fluorouracil encapsulated alginate beads for the treatment of breast cancer, Int. J. Pharm,
2002, 242, 267-269.
(5) V. R. Babu, M. Sairam, K. M. Hosamani, T. M. Aminabhavi, Development of 5-fluorouracil loaded poly(acrylamide-co-methylmethacrylate) novel core-shell microspheres: in vitro release studies, Int. J. Pharm, 2006, 325, 55-62.
(6) S. Bai, C. Thomas, F. Ahsan, Dendrimers as a carrier for pulmonary delivery of Enoxaparin, a low molecular weight Heparin, J. Pharm. Sci, 2006, 96, 2090- 2105.
(7) D. Bhadra, S. Bhadra, S. Jain, N. K. Jain, Int. J. Pharm, 2003, 257, 111.
(8) U. Boas, J. B. Christensen, P. M. Heegaard, Dendrimer in Medicine and biotechnology New Molecular Tools, the Royal society of chemistry, 2006.
(9) T. Chandy, G. S. Das, G. H. Rao, 5-fluorouracil-loaded chitosan coated polylactic acid microspheres as biodegradable drug carriers for cerebral tumours, J. Microencapsul, 2000, 17, 625-638
(10) S. J. Chang, G. C. C. Niu, S. M. Kuo, S. F. Chen, Preparation and preliminary characterization of concentric multi-walled chitosan microspheres, J. Biomed.
Mat. Res. A, 2006, 81, 554-566.
(11) A. S. Chauhan, S. Sridevi, K. B. Chalasani, A. K. Jain, S. K. Jain, N. K. Jain, P. V. Diwan, Dendrimer mediated transdermal delivery: Enhanced bioavailability of indomethacin, J. Control. Release, 2003, 90, 335–343.
(12) H. T. Chen, M. F. Neerman, A. R. Parrish, E. E. Simanek, J. Am. Chem. Soc,
2004, 126, 10044
(13) Y. Y. Cheng, T. W. Xu, M. Li, Potential of polyamidoamine dendrimer used as carrier of camphothecin based on encapsulation studies, Eur. J. Med. Chem,
2007, 43, 1-5.
(14) K. Chie, R. Celeste, U. Yasuhito, K. Hisataka, K. Kenji, Influence of dendrimer generation and polyethylene glycol length on the biodistribution of PEGylated dendrimers, International Journal of Pharmaceutics, 2010, 383, 293–296.
(15) H. Cho, D. Chung, A. Jeongho, Poly(D,L-lactide-ran-ε-caprolactone)- poly(ethylene glycol)-poly(D,L-lactide-ran-ε-caprolactone) as parenteral drug- delivery systems, Biomaterials, 2004, 25, 3733-3742.
(16) P. Couvreur, B. Kante, M. Roland, P. Guiot, P. Bauduin, P. Speiser, Polycyanoacrylate nanocapsules as potential lysosomotropic carriers: preparation, morphological and sorptive properties, J. Pharm. Pharmacol,
1979, 31, 331-332.
(17) T. B. Douce, N. Ahuja, A. Kotlyar, T. P. Thomas, J. R. Baker, Preclinical antitumor efficacy evaluation of dendrimer-based methotrexate conjugates,
Anticancer Drugs, 2008, 19, 43-49.
(18) R. R. Dubey, R. H. Parikh, Two-stage optimization process for formulation of chitosan microspheres, AAPS Pharm. Sci. Tech, 2004, 5, E5.
(19) G. D. Guerra, P. Cerrai, M. Tricoli, S. Maltinti, Release of 5-fluorouracil by biodegradable poly(ester-ether-ester)s. Part I: release by fused thin sheets, J.
Mater. Sci. Mater. Med, 2001, 12, 313-317.
(20) K. Jain, P. Kesharwani, U. Gupta, N. K. Jain, Dendrimer toxicity: Let’s meet the challenge, International Journal of Pharmaceutics, 2010, 394, 122–142. (21) A. Kailasan, Q. Yuan, H. Yang, Synthesis and characterization of
thermoresponsive polyamidoamine polyethylene glycol-poly(D,L-lactide) core shell nanoparticles, Acta Biomaterialia, 2009.
(22) Kobayashi, Positive effects of polyethylene glycol conjugation to generation-4 polyamidoamine dendrimers as macromolecular MRI contrast agents, Magn.
Reson. Med, 2001, 46, 781-788.
(23) C. Kojima, K. Kono, K. Maruyama, T. Takagishi, Synthesis of polyamidoamine dendrimers having poly (ethylene glycol) grafts and their ability to encapsulate anticancer drugs, Bioconjug. Chem, 2000, 11, 910-917.
(24) J. Kreuter, H. R. Hartmann, Comparative study on the cytostatic effects and the tissue distribution of 5-fluorouracil in a free form and bound to polybutylcyanoacrylate nanoparticles in sarcoma 180-bearing mice, Oncology,
1983, 40, 363-366.
(25) V. Krishnam, Design and synthesis of nanoparticle “paint-brush” like
multi-hydroxyl capped poly (ethylene glycol) conjugate for cancer nanotherapy, The graduate faculty at the university of Akron, 2008, 9-30
(26) Y. S. R. Krishnaiah, V. Satyanarayana, B. D. Kumar, R. S. Karthikeyan, In vitro drug release studies on guar gum-based colon targeted oral drug delivery systems of 5-fluorouracil, Eur. J. Pharm. Sci, 2002, 16, 185-192.
(27) P. Kumar, Dendrimer: A novel polymer for drug delivery, Jitps, 2010, 1 (6), 252-269
(28) Y. Lin, Q. Chen, H. Luo, Preparation and characterization of N-(2 carboxybenzyl)chitosan as a potential pH-sensitive hydrogel for drug delivery,
(29) L. G. Martini, J. H. Collett, D. Attwood, The release of 5-fluorouracil from microspheres of poly(epsilon-caprolactone-co-ethylene oxide), Drug Dev. Ind.
Pharm, 2000, 26, 7-12.
(30) S. H. Medina, E. H. Mohamed, Dendrimers as Carriers for Delivery of Chemotherapeutic Agents, Chem. Rev, 2009, 109, 3141–3157.
(31) G. Mukherji, R. S. R. Murthy, B. D. Miglani, Preparation and evaluation of polyglutaraldehyde nanoparticles containing 5-fluorouracil, Int. J. Pharm, 1989,
50, 15-19.
(32) R. Narayani, P. Rao, Gelatin microsphere cocktails of different sizes for the controlled release of anticancer drugs, Int. J. Pharm, 1996, 143, 255-258.
(33) M. F. Neerman, The efficiency of a PAMAM dendrimer toward the encapsulation of the antileukemic drug 6-mercaptopurine, AntiCancer Drugs,
2007, 18, 839-842.
(34) G. R. Newkome, Z. Yao, G. R. Baker, V. K. Gupta, J. Org. Chem, 1985, 50, 2003-2004.
(35) Y. Ohya, H. Kobayashi, T. Ouchi, Design of poly(α-malic acid)-5FU- saccharide conjugate exhibiting antitumor activity, React. Polym, 1991, 15, 153-163.
(36) J. H. Park, L. Seulki, J. H. Kim., K. Park, K. Kim, I. C. Kwon, Polymeric