Bột cây tắc kè đá khô (m = 2 kg) được tận trích với ethanol 96% bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao ethanol dạng sệt có khối lượng 205 g.
Hòa cao sệt với một lượng tối thiểu ethanol và tẩm với silica gel, đuổi khô dung môi trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 40°C cho đến khi thu được bột tơi. Sắc ký cột (SKC) silica gel cao ethanol lần lượt với các dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol. Cô đuổi dung môi các dịch trích dưới áp suất kém thu được các cao tương ứng. Quá trình điều chế cao thô được tóm tắt theo sơ đồ 1.
Tận trích bằng ethanol 96°
- Lọc bỏ bã, cô giảm áp dịch chiết Bột cây tắc kè đá
m = 2 kg
Cao ethanol m = 205 g
- Hoà với lượng nhỏ ethanol, tẩm silica gel đến khi thành bột tơi. - SKC silica gel với các dung môi: C6H14, CHCl3 , AcOEt, MeOH. - Cô quay dịch chiết
Sơ đồ 1 Quy trình điều chế các cao thô từ cây tắc kè đá
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi chỉ khảo sát cao n-hexane (DBH) và cao chloroform (DBC).
2.3.3.1 Cao n-hexane (DBH)
Thực hiện sắc ký cột cao n-hexane (m = 47 g) trên silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-hexane:ethyl acetate (H:EA) (0-100% EA), các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 5 phân đoạn, mã hóa thành H1-5. Quá trình thực hiện được tóm tắt trong sơ đồ 2.
Sơ đồ 2 Quy trình điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane
Cao n-hexane m = 47 g
Hoà với lượng nhỏ MeOH, tẩm silica gel, cô đến bột tơi khô. SKC silica gel với hệ dung môi H: EA = (0% - 100% EA).Cô cạn dịch trích. Cao H1 m = 6,5 g Cao H2 m=10,5 g Cao H3 m =12 g Cao H4 m = 3,3 g Cao H5 m =6,6 g
2.3.3.1.1 Phân lập các chất từ cao H3
Cao H3 (12 g) được SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexane:ethyl acetate với độ phân cực tăng dần (0-100% EA), dựa vào kết quả trên SKLM gom các phân đoạn giống nhau thành 6 phân đoạn (H31-36). Kết quả được tóm tắt trong bảng 1.
Bảng 1 Kết quả sắc ký cột cao H3
Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Khối lượng (mg)
1 H31 Vệt kéo dài 360 2 H32 1 vết chính 2713,5 3 H33 Vệt kéo dài 1205,9 4 H34 2 vết chính 2796,2 5 H35 Vệt kéo dài 1146,5 6 H36 Vệt kéo dài 1371,5
2.3.3.1.2 Khảo sát phân đoạn 4 (H34)
Cao H34 (m = 2796,2 mg) được SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải n-
hexane : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần (1-100% EA), các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung thu được 7 phân đoạn (H341-7).
Phân đoạn H343 (m = 768,4 mg) có một vết chính màu vàng khi giải li, tiếp tục SKC Sephadex LH20 nhiều lần (dung môi rửa giải CHCl3:MeOH = 1:1), dựa vào kết quả trên SKLM thu được 6 phân đoạn (H3431-6). Trong đó, phân đoạn H3432 thu được hợp chất sạch màu vàng, ký hiệu DBH1 (m = 5 mg). Quá trình phân lập DBH1 được tóm tắt theo sơ đồ 3.
H34 (2796,2 mg)
H343 (768,4 mg)
SKC silica gel, H:EA (1-100%)
7 phân đoạn (H341-7)
SKC Sephadex LH20, CHCl3: MeOH (1:1)
H32 (2713,5 mg)
H323 (802 mg)
H3236 (430 mg)
H32362 (250 mg)
SKC silica gel, H:EA (0-100% EA)
6 phân đoạn (H321-6)
SKC silica gel, H:EA (1-100% EA)
8 phân đoạn (H3231-8)
SKC Sephadex LH20 (CHCl3: MeOH = 1:1)
3 phân đoạn (H32361-3)
SKC đảo Rp 18, CH3OCH3:H2O = 3:1
5 phân đoạn (H323621-5)
Sơ đồ 3 Phân lập hợp chất DBH1 từ cao H34
2.3.3.1.3 Khảo sát phân đoạn 2 (H32)
Cao H32 (m = 2713,5 mg) được SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải n-
hexane : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần (0-100% EA), các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung thành 6 phân đoạn, kí hiệu H321-6.
Phân đoạn H323 (m = 802 mg) có một vết chính không màu khi hiện bằng H2SO4 cho màu vàng chanh. Tiếp tục SKC silica gel H323, hệ dung môi rửa giải
n-hexane:ethyl acetate với độ phân cực tăng dần (1-100% EA), dựa vào kết quả trên SKLM gom được 8 phân đoạn (H3231-8). Chọn phân đoạn 6 (H3236, m = 430 mg) tiến hành SKC Sephadex LH20 nhiều lần (dung môi rửa giải CHCl3:MeOH = 1:1), dựa vào kết quả trên SKLM gom thành 3 phân đoạn (kí hiệu H32361-3). Phân đoạn H32362 (m = 250 mg) tiếp tục SKC silica gel Rp18, với hệ dung môi rửa giải CH3OCH3:H2O = 3:1, dựa vào sự giống nhau trên SKLM gom thành 5 phân đoạn (H323621-5). Chọn phân đoạn H323622 (m = 33,5 mg) qua SKC silica gel Rp18 với hệ dung môi CH3OCH3:H2O = 1:1 thu được hợp chất sạch DBH2 (m = 7 mg). Quá trình phân lập DBH2 được tóm tắt trong sơ đồ 4.
SKC đảo Rp 18, CH3OCH3:H2O = 1:1 H323622 (33,5 mg)
Sơ đồ 4 Phân lập hợp chất DBH2 từ cao H32
2.3.3.1.4 Khảo sát phân đoạn H345 (m = 1139,7 mg)
Cao H345 (m = 1139,7 mg) được SKC silica gel, dung môi rửa giải n-hexane : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần (1-100% EA), các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom thành 5 phân đoạn, kí hiệu H3451-5.
Phân đoạn H3453 (m = 698,8 mg) được SKC Sephadex LH20 (CHCl3:MeOH = 1:1), dựa vào kết quả trên SKLM thu được 4 phân đoạn (kí hiệu H34531-4). Tiếp tục SKC Sephadex LH20 (CHCl3:MeOH = 1:1) phân đoạn H34534 (m = 347 mg), dựa vào kết quả trên SKLM thu được 3 phân đoạn (kí hiệu H345341-3). Trong đó, phân đoạn H345343 (m = 250 mg) có chứa vết màu nâu tương đối sạch, tiếp tục SKC silica gel Rp 18, với hệ dung môi rửa giải CH3OCH3:H2O = 3:1 thu được hợp chất sạch màu trắng ngà (m = 60 mg). Sau khi điều chế bằng HPLC thu được 2 chất sạch, ký hiệu DBH3 (m = 12 mg) và DBH4 (m = 6 mg). Quá trình phân lập tóm tắt theo sơ đồ 5
H345 (1139,7 mg)
H3453 (698,8 mg)
H34534 (347 mg)
SKC silica gel, H:EA (1-100% EA)
5 phân đoạn (H3451-5) SKC Sephadex LH20, CHCl3: MeOH (1:1) 4 phân đoạn (H34531-4) SKC đảo Rp 18, CH3OCH3:H2O = 3:1 Chạy HPLC SKC Sephadex LH20, CHCl3: MeOH (1:1) 3 phân đoạn (H345341-3) H345343 (250 mg)
Sơ đồ 5 Phân lập hợp chất DBH3 và DBH4 từ cao H345
2.3.3.2 Cao chloroform (DBC)
Cao C (m = 18,7 g) được SKC silica gel, dung môi rửa giải n-hexane:ethyl acetate (0-100% EA) và ethyl acetate:methanol (0-100% MeOH) thu được 20 phân đoạn, dựa vào SKLM gom thành 6 phân đoạn, kí hiệu C1-6. Kết quả được tóm tắt trong bảng 2.
Bảng 2 Kết quả sắc ký cột cao C
Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Khối lượng (g)
1 C1 Vệt kéo dài 0,8
2 C2 Vệt kéo dài 4,2
3 C3 1 vết chính 4,2
4 C4 2 vết chính 6,0
5 C5 Vệt kéo dài 2,7
6 C6 Vệt kéo dài 2,0
2.3.3.2.1 Khảo sát phân đoạn C3 (m = 4,2 g)
Cao C3 (m = 4,2 g) được SKC Dianion, dung môi rửa giải H2O:MeOH với độ phân cực giảm dần (0-100% MeOH) thu được 4 phân đoạn, kí hiệu C31-4. Sau đó SKC Sephadex LH20 phân đoạn C34 (m = 1,5 g), dung môi rửa giải CHCl3:MeOH = 1:1, các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung thành 3 phân đoạn, kí hiệu C341-3.
Phân đoạn C342 (m = 60 mg) được SKC silica gel Rp 18, hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O = 1:5, các phân đoạn giống nhau trên SKLM gom thành 4 phân đoạn (C3421-4), trong đó phân đoạn C3423 (m = 17 mg) cho 1 vết chính màu vàng nhạt tương đối sạch, phân đoạn này được SKC Sephadex LH20 (dung môi rửa giải CHCl3:MeOH = 1:1) thu được hợp chất sạch màu vàng, ký hiệu DBC1 (m = 9 mg). Quá trình phân lập DBC1 được tóm tắt theo sơ đồ 6.
SKC Sephadex LH20, CHCl3 : MeOH (1:1)
3 phân đoạn (C341-3) C342 (m = 60 mg)
SKC silica gel Rp 18, MeOH:H2O = 1:5
4 phân đoạn (C3421-4) C3423 (m = 17 mg)
SKC Sephadex LH20, CHCl : MeOH = 1:1 Cao C3 (m = 4,2 g)
SKC Dianion, H2O: MeOH (0-100% MeOH)
4 phân đoạn (C31-4) C34 (m = 1,5 g)
Sơ đồ 6 Phân lập hợp chất DBC1 từ cao C3
2.3.3.2.2 Khảo sát phân đoạn C4 (m = 6 g)
Cao C4 (m = 6 g) được SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexane:ethyl acetate với độ phân cực tăng dần (30-100% EA), thu được 5 phân đoạn, kí hiệu C41-5. Kết quả được tóm tắt trong bảng 3.
Bảng 3 Kết quả sắc ký cột cao C4
Cao C44 (m = 400,3 mg) được SKC Sephadex LH20, hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH = 1:1, các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom thành 3 phân đoạn, kí hiệu C441-3.
Phân đoạn C441 (m = 70 mg) được SKC Silica gel, hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH (0-100% MeOH), dựa vào kết quả trên SKLM thu được 4 phân đoạn
Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Khối lượng (mg)
1 C41 Vệt kéo dài 405,5
2 C42 1 vết dài 1246,5
3 C43 4 vết chính 1367,8
4 C44 1 vết chính 400,3
(C4411-4). Trong đó, phân đoạn C4412 (m = 20 mg) có 1 vết vàng chính. Tiếp tục lấy phân đoạn C4412 SKC silica gel Rp 18, hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O = 1:3 thu được hợp chất sạch màu vàng nhạt, kí hiệu DBC2 (m = 5 mg).
C4 (m = 6 g)
SKC silica gel, H:EA (30-100% EA)
5 phân đoạn (C41-5) C44 (m = 400,3 mg) SKC Sephadex LH20, CHCl3:MeOH = 1:1 3 phân đoạn (C441-3) C441 (m = 70 mg) C4412 (m = 20 mg)
SKC Silica gel, CHCl3: MeOH (0-100% MeOH)
4 phân đoạn (C4411-4)
Sơ đồ 7 Phân lập hợp chất DBC2 từ cao C4
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
&