Phương pháp tiến hành

2.1.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

Sử dụng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, pha đảo Rp18, SKC Sephadex LH20 kết hợp SKLM.

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4/EtOH hay FeCl3/EtOH.

2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Điểm nóng chảy được đo trên máy Electrothermal IA 9000 series, dùng mao quản không hiệu chỉnh của phòng các hợp chất thiên nhiên, Viện Hóa học, 1 Mạc Đỉnh Chi, Quận 1, TP. HCM.

Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LCMSD Trap của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

2.1.3.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

Việc thử nghiệm các hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập từ cây tắc kè đá nhằm tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính làm cơ sở cho những nghiên cứu định hướng tiếp theo sử dụng có hiệu quả nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá của nước nhà.

Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất phân lập được.

2.1.3.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

• Phương pháp được tiến hành theo hai bước:

- Bước 1: thử định tính theo phương pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng khoanh giấy lọc đã tẩm chất theo nồng độ tiêu chuẩn.

- Bước 2: các mẫu có hoạt tính (+) sẽ được tiến hành thử tiếp để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietinck.30

• Quy trình khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicribial assay) - Nguyên liệu:

+ Mẫu thử được chuẩn bị theo một quy trình thống nhất tại Viện hóa hợp chất thiên nhiên đã xây dựng.

+ Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:

 Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)

 Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212) Staphylococcus aureus.

 Nấm mốc: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum.

 Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.

 Ampicilin đối với vi khuẩn Gr (+)

 Tetracylin đối với vi khuẩn Gr (-)

 Nystatin đối với nấm sợi và nấm men.

+ Các pha kháng sinh: pha trong DMSO 100% với nồng độ: ampicilin 50 mM, tetracylin 10 mM, nystatin 0,04 mM.

+ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

 Môi trường duy trì và bảo vệ giống: Saboraud dextrose broth cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường trypcase soya broth (TSB).

 Môi trường thí nghiệm: eugon borth cho vi khuẩn Myco phil cho nấm.

• Phương pháp tiến hành và đọc kết quả:

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietinck (1991), hiện đang được áp dụng tại trường Đại Học Tổng Hợp Illinois, Chicago, Mỹ.

- Bước 1: sàng lọc sơ bộ tìm chất chiết có hoạt tính + Chuẩn bị vi sinh vật

Nấm được duy trì trong môi trường dinh dưỡng nêu ở phần nguyên liệu phương pháp. Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24h đối với vi khuẩn, 48h đối với nấm). Sau đó được pha loãng tới nổng độ 0,5 đơn vị Mc Fland để tiến hành thí nghiệm.

+ Chuẩn bị mẫu thử:

Hòa tan các chiết phẩm trong dung dịch DMSO 100% bằng máy vorte với nồng độ 4-10 mg/ml.

Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng, mỗi giếng 10 µl mẫu.

Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn 190 µl vi sinh vật đã hoạt hóa. Đối chứng dương:

Dãy 1: môi trường

Dãy 2: kháng sinh + vi sinh vật kiểm định. Đối chứng âm: chỉ có vi sinh vật kiểm định.

Để trong tủ ấm 37°C/24h đối với vi khuẩn và 30°C/48h đối với nấm. Đọc kết quả:

Mẫu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt, không có vi sinh vật phát triển, giống như hình ảnh ở các giếng chứng âm tính. Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC.

- Bước 2: tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính

Các bước tiến hành như bước 1: riêng mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần từ 5-10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.

Đọc kết quả:

Nồng độ dương tính là ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU < 5.

Mẫu thô có MIC ≤ 200 µg/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính. 2.1.3.3.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa

Hoạt tính chống oxi hóa của các chất tinh khiết phân lập được thử bằng phương pháp DPPH ở phòng sinh học thực nghiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam.

Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxygen radical absorbane capacity (ORAC), Total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH),… Tuy nhiên ở đây chúng tôi chọn phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH vì những ưu điểm của nó so với các phương pháp khác như sau:

• Tiến hành nhanh chóng.

• Thích hợp nhiều tác nhân chống oxi hóa.

• Ngoài ra, nó còn được dùng đo tính chống oxi hóa cho các sản phẩm thực phẩm.

Tên khoa học của DPPH là 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác.

N N O2N O2N NO2 . DPPH (52)

Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng như sau:

N N O2N O2N NO2 . + RH N HN O2N O2N NO2+ R.

• Dung môi của phản ứng:

Kết quả của nhiều nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng methanol và ethanol là hai dung môi tốt nhất và không cần điều chỉnh pH trong dung môi methanol hay ethanol đang dùng.

Giá trị bước sóng hấp thu cực đại khi tiến hành đo mẫu theo mỗi tác giả có sự khác nhau, nhưng trên thực tế kiểm nghiệm thì đỉnh hấp thu cực đại nằm ở bước sóng khoảng 515-520 nm.

• Thời gian phản ứng:

Thời gian phản ứng phụ thuộc vào hàm lượng các chất đem phản ứng. Thời gian tốt nhất là 30 phút sau khi phản ứng.

• Phương pháp tiến hành:

Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và cộng sự (2003). Phương pháp sàng lọc sơ bộ khả năng bẫy gốc tự do trên phiến 96 giếng:

Phản ứng được tiến hành dựa trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm.

Tính kết quả:

Tính giá trị % hoạt động SC% (Scavenging Capacity): Giá trị trung bình của SC % được đưa vào chương trình xử lý số liệu Microsoft Office Excel tìm ra % trung bình độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại ba lần theo công thức:

OD thí nghiệm - OD mẫu trắng

SC% = [100 - x 100].σ

OD chứng âm tính

Độ lệch tiêu chuẩn σ tính theo công thức của Ducan như sau: Σ xi x )2

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50.

• Giá trị SC50(µg/ml):

Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 được xác định bằng chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 0% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hoà bởi chất thử theo công thức:

1/Y=a+blnX Trong đó Y: Nồng độ chất thử

X: Giá trị SC (%)