XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 35 .1 Xác định cấu- 123docz.net

3.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất DBH1

OH O OH

CH3

Hợp chất DBH1 phân lập được dưới dạng kết tinh hình kim màu vàng. Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi giải li n-hexane : ethyl acetate (8 : 1) cho một vết tròn màu vàng hiện hình bằng dung dịch H2SO4/ethanol xuất hiện vết tròn màu cam có Rf = 0,5.

Nhiệt độ nóng chảy 194-196°C.

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI - MS (phụ lục 6) của hợp chất DBH1 cho đỉnh ion phân tử tại m/z: 255,06576 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C15H10O4.

Phổ 1H-NMR (phụ lục 1) của DBH1 cho hai mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của hai nhóm hydroxy kiềm nối [ δH 12,02 (1H, s) và 11,95 (1H, s)] (tương ứng với OH-1 và OH-8), hai proton hương phương ghép cặp meta δH 7,62 (1H, d, J = 1 Hz, H4) và 7,19 (1H, d, J = 1 Hz, H2). Ngoài ra còn có ba proton hương phương của vòng benzene thứ hai δH 7,82 (1H, t, J = 15,5 và 7,5 Hz, H6), 7,78 (1H, dd, J = 1,5 Hz và 7,5 Hz, H5), 7,36 (1H, dd, J = 1 Hz và 8 Hz, H7) và ba proton của một nhóm methyl ở trường cao [δH 2,50 (3H), s].

Phổ 13C-NMR (phụ lục 2) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 3) của DBH1 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 15 carbon bao gồm 2 carbon carbonyl ở δC 182,2 và 193,7, 5 carbon bậc bốn, 7 carbon bậc ba trong đó có 2 carbon mang oxygen ở δC 163,2, 1 nhóm methyl ở δC 22,1. Với công thức phân tử C15H10O4

(Ω = 11) thì DBH1 phải có hai liên kết C=O ghép vòng với hai vòng benzene.

Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán DBH1 là một anthraquinone 15 carbon mang ba nhóm thế, trong đó có một nhóm methyl và hai nhóm hydroxy kiềm nối.

1 3 2 5 4

7 8 9

10 8a 9a

10aB A

Hình 2 Khung anthraquinone

Phổ HMBC (phụ lục 5) cho thấy DBH1 có hai proton hương phương [δH 7,62 (1H, d, J = 1 Hz) và δH 7,80 (1H, dd, J = 7,5 và 1,5 Hz)] tương quan với cùng một carbon carbonyl [δC 182,2 (C10)]. Do đó, hai proton này phải thuộc hai vòng benzene khác nhau lần lượt gắn ở vị trí C4 [δC 121,6] và C5 [δC 120,3]. Như vậy hai nhóm hydroxy kiềm nối phải gắn ở vị trí C1 [δC 163,2] và C8 [δC 163,2]. Đồng thời nhóm carbonyl còn lại δC 193,7 là C9.

Mặt khác, phổ HMBC còn cho tín hiệu proton hương phương của vòng A ở δH

7,19 (1H, d, J = 1 Hz) tương quan với một carbon bậc ba sp2 ở δC 121,6 (C4) và một carbon bậc bốn δC 114,7 (C9a). Như vậy proton này là H2 và carbon mang proton là C2 [δC 124,9]. Với hằng số ghép cặp J = 1 Hz thì proton H2 này đã ghép cặp meta với proton hương phương H4 ở δH 7,62 (1H, d, J = 1 Hz). Trên phổ HMBC thì proton H4 cho tương quan với một carbon bậc bốn C2 [δC 124,9] và một carbon carbonyl C10 [δC 182,2]. Do đó nhóm methyl phải được gắn ở C3 [δC 150,6]. Kiểm tra bằng phổ HMBC cũng cho thấy tương quan giữa nhóm methyl với C3 và hai carbon olefine ở [δC 124,9 (C2), 121,6 (C4)].

Mặt khác, trên phổ HMBC cho thấy tín hiệu tương quan của proton hương phương ở [δH 7,84 (1H, t, J = 7,5 Hz)] với hai carbon olefine [δC 163,2 (C8), 134,3 (C10a)]. Như vậy proton này là H6. Hai proton [δH 7,80 (1H, dd, J = 7,5 và 1,5 Hz)]

và [δH 7,36 (1H, dd, J = 8,0 và 1,5 Hz)] cùng ghép cặp ortho với H6, cùng cho tương quan với C8a [δC 116,8] có thể là H5 hoặc H7. Phổ HMBC còn cho thấy tương quan giữa proton δH 7,80 với carbon olefine δC 125,1 (C7) và một carbon carbonyl C10, do đó proton này là H5. Proton còn lại (δH 7,36) là H7 còn cho tương quan thêm với carbon olefine δC 120,3 (C5). Các tương quan được minh họa trong hình 3 và 4.

Hình 3 Phổ HMBC của DBH1

OH O OH

CH3 H

H H

1 H

3 2 5 4

7 8 9

10 8a 9a 10a 4a

Tương quan HMBC Hình 4 Tương quan HMBC của DBH1

Bảng 4 So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR với Chrysophanol và tương quan HMBC của DBH1 trong dung môi aceton-d6 [22]

Vị trí

DBH1 Chrysophanol DBH1 Chryso

-phanol

Tương quan HMBC ( 1H → 13C)

δ δ 2J 3J

1 163,2 162,7

2 7,19 (1H,d, J = 1) 7,21 (1H, brs) 124,9 124,3 4, 9a

3 150,6 149,8

4 7,62 (1H,d, J = 1) 7,65 (1H, brs) 121,6 120,9 2, 9a, 10 5 7,80 (1H, dd,

J = 7,5 và 1,5)

7,84 (1H, dd,

J = 8,0 và 1,5) 120,3 119,6 7, 8a, 10 6 7,84 (1H, t,

J = 7,5)

7,83 (1H, t,

J = 8,0) 138,2 137,5 8, 10a

7 7,36 (1H, dd, J = 1,5 và 8)

7,37 (1H, dd,

J = 1,5 và 8) 125,1 124,7 6,8 5, 8a

8 163,2 162,7

9 193,7 192,9

10 182,2 181,7

4a 134,7 134,1

8a 116,8 116,2

9a 114,7 114,2

10a 134,3 133,8

-CH3 2,50 (3H, s) 2.11 (3H, s) 22,1 21,4 3 2, 4

Từ những nhận định trên kết hợp với so sánh dữ liệu phổ thì hợp chất DBH1 được xác định là 1,8-dihydroxy-3-methylanthracenedion hay chrysophanol (53).Đây là lần đầu tiên chrysophanol được cô lập từ chi Drynaria.26

OH O OH

CH3

3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất DBH2

O 1' 2'

3' 4' 5'

6' 7' 8'

9' 10'

11' 12'

13' 12'a 2

4 3 6 5

7 8 8a

8b 4a

4'a 8'a

Hợp chất DBH2 thu được dưới dạng dầu màu vàng nhạt. Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi giải li n-hexane : ethyl acetate (7 : 1) cho một vết tròn hiện hình bằng dung dịch H2SO4/ethanol xuất hiện vết tròn màu vàng chanh, có Rf = 0,53.

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI - MS (phụ lục 12) của hợp chất DBH2 cho đỉnh ion phân tử tại m/z: 431,4 [M+H]+ (positive) , 465,3 [M-H+2H2O]- (negative) ứng với công thức phân tử C29H50O2.

Phổ 1H-NMR (phụ lục 7) cho thấy tín hiệu của 4 nhóm methyl ở vùng trường cao δH [0,81 (3H, m, H4′a), 0,83 (3H, m, H8′a), 0,86 (3H, m, H12′a), 0,87 (3H, m, H13′)], một tín hiệu singlet với cường độ cao ở δH 1,23 (3H, s, H2a), 3 tín hiệu singlet chồng lấp vào nhau dịch chuyển nhiều về phía trường thấp hơn ở δH [2,11 (3H, s, H5a), 2,11 (3H, s, H8b) và 2,16 (3H, s, H7a)] chứng tỏ 3 nhóm methyl này phải được nối với 1 vòng thơm. Ngoài ra còn xuất hiện 1 mũi triplet của nhóm methylen ở δH 2,60 (2H, t, J = 7 Hz, H4), 1 nhóm methylen khác δH 1,78 (2H, m, H3), 1 proton nhóm hydroxy ở δH 4,18 (s). Sự vắng mặt hoàn toàn của các proton hương phương chứng tỏ vòng benzene này đã bị thế cả 6 vị trí.

Phổ 13C-NMR (phụ lục 8) và DEPT (phụ lục 9) cho thấy tín hiệu của 29 carbon, với 8 carbon bậc một, 11 carbon bậc hai, 3 carbon bậc ba, 7 carbon bậc bốn trong đó có 1 carbon bậc bốn sp3 mang oxygen (δC 74,5) và 6 carbon sp2 của vòng benzene

trong đó có 2 carbon bậc ba mang oxygen (δC 117,3, 118,4, 121,0, 122,6, 144,5, 145,5). Với công thức phân tử C29H50O2 (Ω = 5) thì DBH2 có hai vòng thuộc khung chroman. Như vậy ở δC 145,5 là carbon bậc ba kề oxygen (C8a), δC 74,5 là carbon bậc bốn sp3 kề oxygen (C2). Còn một carbon bậc ba ở δC 144,5 là carbon mang nhóm hydroxy (C6).

Phổ HMBC (phụ lục 11) cũng chứng tỏ nhóm hydroxy nằm ở vị trí C6 vì có sự tương quan giữa proton của nhóm hydroxy [δH 4,18 (1H, s)] với ba carbon bậc bốn sp2 C5 (δC 118,4), C6 (δC 144,5) và C7 (δC 121,0). Mặt khác phổ cũng cho thấy tương quan của 3 nhóm methyl gắn vào vòng benzene [δH 2,10 (3H, s), 2,11 (3H, s), 2,16 (3H, s)] với lần lượt C5 (δC 118,4), C7 (δC 121,0), C8 (δC 122,6). Như vậy 3 nhóm methyl này lần lượt là C5a (δC 11,2), C7a (δC 12,2) và C8b (δC 11,7).

Ngoài ra, phổ HMBC còn thể hiện sự tương quan của proton H4 ở δH 2,60 (2H, t, J = 7 Hz) lần lượt với một nhóm methylen δC 31,5 (C3), một carbon bậc ba sp3 mang oxygen δC 74,5 (C2), một carbon bậc bốn sp2 δC 117,3 (C4a), một carbon bậc ba mang oxygen δC 145,5 (C8a). Proton nhóm methylen H3 [δH 1,78 (2H, m)] cho tương quan với C4 (δC 20,7) và C2 (δC 74,5). Một nhóm methyl được gắn vào vị trí C2 vì trên phổ HMBC, proton H2a [δH 1,23 (3H, s)] cho tương quan với một carbon bậc ba sp3 ở δC 74,5 (C2), một carbon sp3 bậc hai ở δC 39,8 (C1′).

Phổ HMBC còn cho tín hiệu tương quan của các proton trên dây nhánh C16H33. Phổ cho phép xác định vị trí các nhóm methyl C4′a , C8′a, C12′a, C13′ [δH 0,81 (3H, m, H4′a), 0,83 (3H, m, H8′a), 0,86 (3H, m, H12′a), 0,87 (3H, m, H13′)] nhờ vào sự tương quan giữa proton của các nhóm methyl lần lượt với các carbon C4′ (δC 32,8), C8′ (δC 32,7), C12 (δC 27,9). Các tương quan được minh họa trong hình 5,6.

Hình 5 Phổ HMBC của hợp chất DBH2

O 1'

2' 3' 4'

5' 6'

7' 8' 9'

10' 11'

12' 13' 12'a 2

4 3 6 5

7 8 8a 8b

7a 5a

4'a 8'a

Hình 6 Tương quan HMBC của hợp chất DBH2

Bảng 5 So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DBH2 với α-tocopherol và tương quan HMBC của DBH2 trong dung môi CDCl3

Vị trí

DBH2 α-Tocopherol DBH2

α-Toco pherol

Tương quan HMBC ( 1H → 13C) δH (ppm), J (Hz) δC (ppm) 2J 3J

2 74,5 74,5

3 1,78 (2H, m) 1,77 (2H, m) 31,5 31,6 4 2a 4 2,60 (2H, t, J = 7) 2,59(2H, t,J = 6,7) 20,7 20,7 3, 4a

5 118,4 118,5

6 144,5 144,5

7 121,0 121,0

8 122,6 122,6

2a 1,23 (3H, s) 1,22 (3H, s) 23,8 23,8 2 1′

4a 117,3 117,3

5a 2,11 (3H, s) 2,10 (3H, s) 11,2 11,2 5 6, 4a

7a 2,16 (3H, s) 2,11 (3H, s) 12,2 12,2 7 6, 8

8a 145,5 145,5

8b 2,11 (3H, s) 2,10 (3H, s) 11,7 11,7 8 7, 8a

1′ 1,51 (2H, m) 1,51-1,55 (m) 39,8 39,8

2′ 1,52 (2H, m) 1,51-1,55 (m) 21,0 21,0

3′ 1,06 (2H, m) 1,06 (m) 37,4 37,5

4′ 1,40 (1H, m) 1,37-1,40 (m) 32,8 32,8

5′ 1,06 (2H, m) 1,06 (m) 37,4 37,4

6′ 24,4 24,4

7′ 1,27 (2H, m) 1,25 (m) 37,4 37,4

8′ 1,42 (1H, m) 1,37-1,40 (m) 32,7 32,7

9′ 1,27 (2H, m) 1,25 (m) 37,3 37,3

10′ 24,8 24,8

11′ 1,14 (2H, m) 1,14 (m) 39,3 39,4

12′ 1,56 (1H, m) 1,51-1,55 (m) 27,9 27,9

13′ 0,87 (3H,s) 0,84-0,87 (m) 22,6 22,6

4′a 0,81 (3H,s) 0,84-0,87 (m) 19,7 19,7 4′ 3′, 5′

8′a 0,83 (3H,s) 0,84-0,87 (m) 19,6 19,6 8′ 7′, 9′

12′a 0,86 (3H,s) 0,84-0,87 (m) 22,7 22,7 12′ 11′,

13′

-OH 4,18 (1H, s) 4,18 (1H, s) 6 5, 7

Dựa vào dữ liệu phổ cùng những nhận định trên kết hợp với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu trúc hợp chất DBH2 là (2R)-2,5,7,8-tetramethyl-2-{(4R,8R)

-(4,8,12-trimethyldecyl)}-6-chromanol (α-tocopherol) (54). Đây là lần đầu tiên α-tocopherol được phân lập từ chi Drynaria.27

O 1'

2' 3' 4'

5' 6'

7' 8' 9'

10' 11'

12' 13' 12'a 2

4 3 6 5

7 8 8a 8b

7a 5a

4'a 8'a

3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất DBH3

Hợp chất DBH3 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 182-184°C.

Phổ 1H-NMR (phụ lục 13) cho thấy tín hiệu của 7 nhóm methyl ở trường cao δH 1,00 (3H, d, J = 6 Hz, CH3-27), 0,99 (3H, d, J = 6 Hz, CH3-26), 0,93 (6H, s, CH3-18 và CH3-30), 0,89 (3H, s, CH3-28), 0,86 (3H, s, CH3-21) và 0,81 (3H, s, CH3-29). Ngoài ra còn có hai mũi doublet nằm ở vùng trường cao [δH 0,56 (1H, d, J = 3,5 Hz, H19α), 0,33 (1H, d, J = 3,5 Hz, H19β] đặc trưng proton cyclopropyl thuộc khung cycloartan.

Phổ 1H-NMR còn cho tín hiệu của nhóm hydroxy ở δH 3,29 (1H, brs, H3), tín hiệu một phần của 2 proton olefine ở δH 4,67 (1H, brs, H31α) và 4,72 (1H, s, H31β) đó là nhóm methylen (=CH2).

Phổ 13C-NMR (phụ lục 14) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 15) cho thấy tín hiệu của 31 carbon bao gồm 7 carbon bậc một, 12 carbon bậc hai trong đó có 1 carbon sp3 bậc hai mang oxygen ở [δC 78,8 (C3)] và 1 carbon olefine ở [δC 105,9], 6 carbon bậc ba, 6 carbon bậc bốn trong đó có 1 carbon olefine ở δC 156,9.

HO 2 1 3 4 5

6 7 9 8 10

1112 13

14171516 18

20 21

22 23 24 25 26

28 29

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS (phụ lục 18) của DBH3 cho đỉnh ion phân tử tại m/z: 441,42657 [M+H]+ , mảnh ion con tại m/z: 423,41488 [M-OH]+ ứng với công thức phân tử C31H52O (Ω = 6).

Kết hợp phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, ESI - MS cũng như những nhận định ban đầu cho thấy DBH3 có khung cycloartan mang nhóm hydroxy ở C3 và trong phân tử DBH3 ngoài khung cycloartan còn có thêm một liên kết đôi C=C.

2 1 3 4 5

6 7 9 8 10

1112 13

14 151716 18

19 20

22 23 24 25 26

28 29

A B 30

Hình 7 Khung cycloartan

Phổ HMBC (phụ lục 17) cho thấy hai nhóm methyl [δH 1,00 (3H, d, J = 6 Hz, CH3-27), 0,99 (3H, d, J = 6 Hz, CH3-26)] cùng cho tương quan với một carbon bậc ba δC 33,8 (C25) và một carbon olefine bậc bốn δC 156,9. Như vậy carbon olefine này là C24. Hai proton không tương đương của carbon olefine còn lại ở [δH 4,67 (1H, brs, H31α) và 4,72 (1H, s, H31β)] cho tương quan với carbon olefine C24, C25, một carbon bậc hai ở δC 31,3 (C23).

Dựa vào phổ HMBC cho thấy ở vòng A, có 2 nhóm methyl bậc ba ở [δH 0,89 (3H, s, CH3-28) và 0,81 (3H, s, CH3-29)] tương quan với nhau và cùng tương quan với 1 carbon bậc bốn δC 40,4 (s), 1 carbon bậc ba và 1 carbon bậc hai mang oxygen. Vậy carbon bậc bốn đó là C4 mang 2 nhóm methyl này, carbon bậc hai mang oxygen là C3 (δC 78,8), carbon bậc ba là C5 (δC 47,1).

H3C CH3 HO

Hình 8 Tương quan HMBC của vòng A

Trên phổ HMBC, nhóm methyl bậc ba ở [δH 0,93 (3H, s)] cho tương quan với một carbon bậc ba δC 48,0, một carbon bậc bốn δC 52,2 và một nhóm methylen ở δC 26,4. Như vậy nhóm methyl này là C30 (δC 25,4) và carbon bậc bốn mang nó là C14, carbon bậc ba là C8, nhóm methylen nói trên là C15.

Nhóm methyl bậc ba có cùng độ dịch chuyển hóa học với C30 [δH 0,93 (3H, s)]

trên phổ HMBC lại cho tương quan với hai carbon bậc bốn ở δC 45,3 và 52,2 (C14), một carbon bậc ba ở δC 48,8. Như vậy nhóm methyl này là C18 và carbon bậc bốn mang nó là C13, carbon bậc ba đó là C17.

Nhóm methyl bậc ba cuối cùng ở [δH 0,86 (3H, d, J = 6,5 Hz)] cho tương quan với C17 và một nhóm methylen ở δC 35,5 (C22) trên HMBC. Vậy nhóm methyl này là C21 được gắn vào C20 (δC 36,1).

Hai proton ở [δH 0,56 (1H, d, J = 3,5 Hz, H19α) và 0,33 (1H, d, J = 3,5 Hz, H19β)] là hai proton đặc trưng của vòng cyclopropyl và carbon mang hai proton này là C19 (δC 29,9). Chúng là hai proton không tương đương và được ghép gem với nhau (phù hợp với hằng số J = 3,5 Hz). Trên HMBC cũng cho tín hiệu tương quan của H19α với C5 (δC 47,1) và proton còn lại H19β với C11 (δC 26,0).

Về mặt hóa học lập thể, nhóm hydroxy gắn vào C3 được định hướng β dựa vào độ dịch chuyển hóa học của proton với carbon ở δH 3,29 (1H, brs) và δC 78,8. Nếu nhóm hydroxy được định hướng α thì độ dịch chuyển hóa học của proton và carbon khoảng δH 3,45 và δC 77,2.31-33

2 1 3 4 5

6 7 9 8 10

1112 13

14 151716 18

20 21

22 23 24

28 29

H H

Hình 9 Tương quan HMBC của DBH3

Dựa vào các dữ liệu phổ cùng những nhận định trên cho phép xác định hợp chất DBH3 là 24-methylene-cycloartan-3β-ol (55). Đây là lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Drynaria.40

Bảng 6 So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DBH3 với 24-methylene- cycloartan-3β-ol và tương quan HMBC trong dung môi CDCl3

Vị trí

DBH3 24-methylene-

cycloartan-3β-ol DBH3

24-methylene- cycloartan-3β-

Tương quan HMBC ( 1H → 13C)

δH (ppm), J (Hz) δC (ppm) 2J 3J

1 31,9 31,9

2 30,4 30,3

3 3.29 (1H, brs) 3.26 (1H, dd,

J = 11 và 4) 78,8 78,8 3 2, 4

4 40,4 40,4

5 47,1 47,1

6 21,1 21,1

HO 2 1 3 4 5

6 7 9 8 10

1112 13

14171516 18

20 21

22 23 24 25 26

28 29

7 28,1 28,1

8 48,0 48,0

9 20,0 19,9

10 26,0 25,7

11 26,0 26,0

12 32,9 32,8

13 45,3 45,2

14 48,8 48,8

15 35,0 34,9

16 26,4 26,4

17 52,2 52,2

18 0,93 (3H, s) 0.94 (3H, s) 18,0 18,0 13 14, 17

0,33 (1H, d, J = 3,5, Hβ)

0,56 (1H, d, J = 3,5, Hα)

0.30 và 0.53 (2H,

d, J = 4.25) 29,9 29,9 9, 10

20 36,1 36,3

21 0,86 (3H, d, J = 6,5)

0.86 (3H, d,

J = 6) 18,3 18,2 20 C17,

22 35,5 35,5

23 31,5 31,3

24 156,9 156,9

25 33,8 33,8

26 0,99 (3H, d, J = 6)

0.99 (3H, d,

J = 3) 22,0 22,0 25 24, 27

27 1,00 (3H, d, J = 6,5)

1.1 (3H, d,

J = 3) 19,3 19,3 25 24, 26

28 0,89 (3H, s) 0.88 (3H, s) 18,6 18,3 4 29, 3. 5

29 0,81 (3H, s) 0.79 (3H, s) 14,0 14,0 4 28, 3, 5

30 0,93 (3H, s) 0.94 (3H, s) 25,4 25,4 14 8, 15

31 4,67 (1H, brs) 4,72 (1H, brs)

4.64(1H,d,J=0,5)

4.69 (1H, brs) 105,9 105,9 24 25

3.2.4 Xác định cấu trúc hợp chất DBH4

H HO

2 1 3 4 5

6 7 9 8 10

1112 13

14 151716 18

19 20

22 23 24 25 26

28 29

Hợp chất DBH4 phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng ngà. Nhiệt độ nóng chảy: 124-125°C.

Phổ 1H-NMR (phụ lục 19) cho tín hiệu đặc trưng ở [δH 0,33 (1H, dd, J = 4 Hz, H19β), 0,55 (1H, brs, H19α)] của vòng cyclopropyl thuộc khung cycloartan. Ngoài ra phổ cũng cho tín hiệu 6 nhóm methyl ở δH [0,82 (3H, s, H28), 0,82 (3H, s, H29), 0,92 (3H, s, H30), 0,92 (3H, s, H18), 0,96 (3H, s, H21)], 1,56 (3H, s, H27). Phổ còn cho tín hiệu của nhóm hydroxy ở δH 3,29 (1H, t, J = 6,5 Hz, J = 4 Hz, H3). Phổ còn cho thấy tín hiệu của 2 proton olefine ở [δH 4,64 (1H, d, J = 2,5 Hz, H26α) và 4,73 (1H, dd, J = 2,5 Hz và 3,0 Hz, H26β)] đó là nhóm methylen (=CH2).

Phổ 13C-NMR (phụ lục 20) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 21) cho thấy tín hiệu của 30 carbon bao gồm 6 carbon bậc một, 12 carbon bậc hai trong đó có 1 carbon mang oxygen ở δC 78.8 (C3) và 1 carbon olefine ở δC 111,3, 7 carbon bậc ba, 5 carbon bậc bốn trong đó có 1 carbon olefine ở δC 147,6.

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI - MS (phụ lục 24) của DBH4 cho đỉnh ion phân tử tại m/z: 427,13265 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C30H50O (Ω = 6).

Phổ HMBC (phụ lục 23) cho thấy proton ở δH 1,56 (3H, m) cùng cho tương quan với một carbon olefine bậc bốn ở δC 147,6 và một carbon olefine bậc hai ở δC 111,3. Carbon mang proton trên là C27, như vậy hai carbon olefine lần lượt là C25 và

C26. Hai proton không tương đương của C26 ở [δH 4,67 (1H, brs, H26α) và 4,72 (1H, s, H26β)] tương quan với carbon olefine C25, một carbon bậc một ở δC 17,7 (C27) và một carbon bậc ba ở δC 49,5 (C24).

Dựa vào phổ HMBC cho thấy ở vòng A, có 2 nhóm methyl bậc ba ở [δH 0,82 (3H, s, CH3-28) và 0,82 (3H, s, CH3-29)] tương quan với nhau và cùng tương quan với 1 carbon bậc bốn δC 40,4 (s), 1 carbon bậc ba (δC 47,1) và một carbon bậc hai sp3 mang oxygen (δC 78,8). Vậy carbon bậc bốn đó là C4 mang 2 nhóm methyl này, carbon mang oxygen là C3, carbon bậc ba nói trên là C5.

Nhóm methyl bậc ba ở [δH 0,92 (3H, s)] trên phổ HMBC lại cho tương quan với một carbon bậc bốn ở δC 45,2, hai carbon bậc ba ở δC 48,7 và 52,3. Như vậy nhóm methyl này là C18 và carbon bậc bốn mang nó là C13, hai carbon bậc ba lần lượt là C14 và C17.

Nhóm methyl bậc ba có cùng độ dịch chuyển hóa học với C18 [δH 0,92 (3H, s)]

trên phổ HMBC lại cho tương quan với một carbon bậc ba ở δC 49,5 (C24), một carbon olefine bậc bốn ở δC 147,6 (C25) và một carbon sp3 bậc hai ở δC 30,3. Như vậy nhóm methyl này là C30 và carbon bậc ba mang nó là C24, carbon bậc hai là C23.

Hai proton ở [δH 0,55 (1H, brs, H19α), 0,33 (1H, dd, J = 4 Hz, H19β)] là hai proton đặc trưng của vòng cyclopropyl và carbon mang hai proton này là C19 (δC

28,1).Chúng là hai proton không tương đương và được ghép gem với nhau (phù hợp với hằng số J = 4 Hz). Trên HMBC cũng cho tín hiệu tương quan của H19α với C5 (δC 47,1) và proton còn lại H19β với C11 (δC 26,0).

Về mặt hóa học lập thể, nhóm hydroxy gắn vào C3 được định hướng β dựa vào độ dịch chuyển hóa học của proton với carbon δH 3,29 (1H, t, J = 6,5 Hz, J = 4 Hz) và δC 78,8. Nếu nhóm hydroxy được định hướng α thì độ dịch chuyển hóa học của proton và carbon khoảng δH 3,45 và δC 77,2.31-33

H HO

2 1 3 4 5

6 7 9 8 10

1112 13

14 151716 18

19 20

22 23 24 25 26

28 29

H H

Hình 10 Tương quan HMBC của DBH4

Dựa vào các dữ liệu phổ cùng những nhận định trên cho phép xác định hợp chất DBH4 là (24S)-24-methyl-5α-cycloart-25en-3β-ol hay cyclolaudenol (56).17

Bảng 7 So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DBH4 với cyclolaudenol và tương quan HMBC của DBH4 trong dung môi CDCl3

Vị trí

DBH4 Cyclolaudenol DHB4 Cyclo

-laudenol

Tương quan HMBC ( 1H → 13C)

δH (ppm), J (Hz) δC (ppm) 2J 3J

1 31,9 31,9

2 29,7 30,4

3 3,29 (1H, t,

J = 6,5 và 4) 3,25 (1H, m) 78,8 78,9

4 40,4 40,5

5 47,1 47,1

6 21,1 21,4

7 28,0 28,1

8 48,0 48,0

9 20,0 20,0

10 26,0 26,1

11 26,0 26,0

12 36,4 36,6

13 45,2 45,3

14 48,7 48,8

15 32,8 32,9

16 26,4 26,5

17 52,3 52,3

18 0,92 (3H, s) 0,91 18,0 17,9 13 14, 17

19 0,33(1H,dd, J=4,Hβ) 0,55 (1H, brs, Hα)

0,30(2H,d,J=4)

0,55(2H,d,J=4) 28,1 29,9 5, 11

20 36,0 36,0

21 0,96 (3H, s) 1,05 (3H, s) 18,0 18,3 20 17

22 29,9 31,0

23 30,3 31,6

24 49,5 41,6

25 147,6 150,3

4,64 (1H, d, J = 2,5) 4,73 (1H, dd, J = 2,5

và 3,0)

4.70 (2H, s) 111,3 109,3 25 24, 27

27 1,56 (3H, s) 1.65 (3H, s) 17,7 18,6 25 26

28 0,82 (3H, s) 0,82 (3H, s) 18,3 19,3 4 29, 5

29 0,82 (3H, s) 0,82 (3H, s) 14,0 14,0 4 28, 5

30 0,92 (3H, s) 0.91 (3H, s) 25,4 25,4 24 23, 25

3.2.5 Xác định cấu trúc hợp chất DBC2

O OCH3 H3CO

H3CO

OCH3

2 4 3 6 5

7 8 9

1'2' 3' 5'4' 6'

Hợp chất DBC2 thu được dưới dạng kết tinh trong aceton hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 136-138°C.

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS (phụ lục 30) của hợp chất DBC2 cho đỉnh ion phân tử tại m/z: 403,25171 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C21H22O8 .

Phổ 1H-NMR (phụ lục 25) cho thấy tín hiệu của 4 proton hương phương ở δH

7,68 (1H, dd, J = 2 và 8,5 Hz), 7,60 (1H, d, J = 2 Hz), 7,16 (1H, d, J = 8,5 Hz) và 6,62 (1H, s). Ngoài ra phổ còn cho tín hiệu 6 mũi singlet của 6 nhóm –OCH3 δH (4,08, 4,05, 3,97, 3,92, 3,89, 3,85).

Phổ 13C-NMR (phụ lục 26) xuất hiện tín hiệu 15 carbon của khung flavone. Dựa vào phổ DEPT (phụ lục 27) có thể xác định chúng gồm có 4 carbon bậc ba ở (δC 107,2, 110,0, 112,7, 120,3), 8 carbon bậc ba mang oxygen (δC 161,6, 149,1, 145,0, 152,3, 139,1, 148,5, 150,7, 153,3), 2 carbon bậc bốn (δC 124,8, 115,8), 1 carbon carbonyl δC 176,6. Trong đó nhóm carbonyl tại δC 176,6 chứng tỏ sự tồn tại nối đôi tại C2 và C3, trong trường hợp C2, C3 không phải nối đôi thì độ dịch chuyển hóa học tại hai vị trớ này giảm rừ rệt khoảng 73,0-80,0 ppm trong khi với C4 lại tăng lờn khoảng 193-198 ppm. Ngoài ra phổ 13C-NMR còn cho tín hiệu của 6 nhóm -OCH3 ở δC (62,3, 62,2, 61,9, 61,9, 56,3, 56,2).

Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán DBC2 là một flavonoid.

Như vậy vòng benzene A mang 4 nhóm thế -OCH3 lần lượt vào C5 (δC 149,1), C6 (δC

145,0), C7 (δC 152,3), C8 (δC 139,1). Vòng benzene B là 1 vòng benzene 1,3,4-tam hoán δH [7,68 (1H, dd, J = 2 và 8,5 Hz), 7,60 (1H, d, J = 2 Hz), 7,16 (1H, d, J = 8,5 Hz)].

2 4 3 6 5

7 8 9

1'2' 3' 5'4' 6'

'B 'C

Hình 11 Khung flavonoid

Kiểm tra lại bằng HMBC (phụ lục 29) proton ở δH 6,62 (1H, s) cho tương quan với một carbon bậc bốn (δC 115,8), một carbon bậc ba mang oxygen (δC 115,8) và nhóm carbonyl C4 (δC 176,6). Như vậy proton này là H3 và carbon mang nó là C3 (δC

107,2), carbon bậc bốn nói trên là C10 và carbon bậc ba là C2. Trên vòng B, hai proton hương phương ở [δH 7,68 (1H, dd, J = 2 và 8,5 Hz), 7,60 (1H , d, J = 2 Hz)]

ghép cặp meta với nhau, cùng cho tương quan với C4′ (δC 153,3) và C2 (δC 161,6).

Như vậy hai proton này có thể là H6′ và H2′. Ngoài ra phổ còn cho thấy tương quan của proton ở δH 7,68 với C2′ (δC 110,0) nên proton này là H6′, proton còn lại sẽ là H2′

cho tương quan thêm với C6′ (δC 120,3).

Trên HMBC còn cho thấy proton hương phương thứ 3 trên vòng B ở [δH 7,16 (1H, d, J = 8,5 Hz)] ghép cặp ortho với proton H6′ cho tương quan với C6′ (δC 120,3) và C3′ (δC 150,7), tương quan yếu với C4′ (δC 153,3). Proton này chính là H5′.

2 4 3 6 5

7 8 9

1'2' 3' 5'4' 6'

H H H

OCH3

OCH3 OCH3

H3CO

OCH3

Hình 12 Tương quan HMBC của các proton hương phương của DBC2

Ngoài ra trên phổ HMBC cũng cho thấy tương quan lần lượt của 4 nhóm thế -OCH3 [δH 3,85, 3,89, 4,05, 4,08] với 4 carbon bậc bốn của vòng A [δC 149,1 (C5), 145,1 (C6), 152,3 (C7),139,2 (C8)], 2 nhóm thế -OCH3 [δH 3,92, 3,97] với 2 carbon bậc bốn vòng B [δC 153,3 (C4′) và 150,7 (C3′)].

O OCH3 H3CO

H3CO

OCH3

2 4 3 6 5

7 8 9

1' 2' 3' 5'4' 6'

Hình 13 Tương quan HMBC của các nhóm –OCH3 của DBC2

Từ dữ liệu phổ và những nhận định trên cho phép xác định hợp chất DBC2 là 5,6,7,8,3′,4′-hexamethoxyflavone (nobiletin) (57). Đây là lần đầu tiên nobiletin được tìm thấy trong chi Drynaria.39

O OCH3

H3CO

OCH3

2 4 3 6 5

7 8 9

1'2' 3' 5'4' 6'

Bảng 8 So sánh 1H-NMR và 13C-NMR của DBC2 với Nobiletin và tương quan HMBC trong dung môi aceton-d6

Vị trí

DBC2 Nobiletin DBC2 Nobiletin

Tương quan HMBC ( 1H → 13C) δH (ppm), J (Hz) δC (ppm) 2J 3J

2 161,6 161,3

3 6,62 (1H, s) 6,74 (1H, s) 107,2 107,2 2, 4 10

4 176,6 177,6

5 149,1 148,7

6 145,1 144,4

7 152,3 151,7

8 139,2 138,3

9 148,5 148,0

10 115,8 115,2

1′ 124,8 124,4

2′ 7,60 (1H, d, J = 2) 7,45(1H, d, J = 2) 110,0 109,0 1′ 2, 4′

3′ 150,7 149,7

4′ 153,3 152,3

5′ 7,16(1H, d, J =8.5) 7,02(1H,d,J=8.5) 112,7 111,6 6′, 3′ 4′

6′ 7,68 (1H, dd, J = 8.5 và 2)

7,61 (1H, dd,

J = 8,5 và 1,7) 120,3 119,9 2′, 4′, 2

-OCH3 4,08 (3H, s) 4,14 (3H, s) 62,3 62,5 7

-OCH3 4,05 (3H, s) 4,05 (3H, s) 62,2 62,2 8

-OCH3 3,97 (3H, s) 3,99 (3H, s) 56,3 56,4 3′

-OCH3 3,92 (3H, s) 3,99 (3H, s) 56,2 56,3 4′

-OCH3 3,89 (3H, s) 3,99 (3H, s) 61,9 62,1 6

-OCH3 3,85 (3H, s) 3,99 (3H, s) 61,9 61,9 5

3.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Bốn hợp chất tinh khiết phân lập được là DBH1, DBH3, DBC2 sau khi thử hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp DPPH và kháng vi sinh vật kiểm định thu được các kết quả trong bảng 9,10.

Bảng 9 Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa Stt Kí hiệu mẫu Nồng độ mẫu

(àg/ml)

SC% SC50

(àg/ml)

Kết quả

1 Chứng (+) 50 88,4±0,0 25,6 Dương tính

2 Chứng (-) - 0,0±0,0 - Âm tính

3 DBC I 50 12,1±0,5 - Âm tính

4 DBC III 50 0,7±0,1 - Âm tính

5 DBH I 50 7,3±0,5 - Âm tính

6 DBH III 50 13,8±0,1 - Âm tính

Kết luận:

Các mẫu DBH1, DBH3, DBC2 không biểu hiện hoạt tính chống oxi hoá trên hệ DPPH.

Bảng 10 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Kết luận

Hợp chất DBH1 biểu hiện hoạt tính kháng vi khuẩn E.coli.

Hợp chất DBH3 biểu hiện hoạt tính kháng vi khuẩn P.aeruginosa.

Hợp chất DBC2 biểu hiện hoạt tính kháng vi khuẩn A.niger.

Chương 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

Trong luận văn này, chúng tôi đã khảo sát thành phần hoá học cao n-hexane và cao chloroform thu được từ thân rễ cây tắc kè đá (Drynaria bonii Christ.) vốn chưa được nghiên cứu ở Việt Nam.

Bằng kỹ thuật SKC trên silica gel pha thường, pha đảo Rp 18 và SKC Sephadex LH20, dianion và HPLC kết hợp với SKLM chúng tôi đã phân lập được năm hợp chất.

Dựa vào các kết quả phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 90 và 135, HSQC, HMBC, ESI- MS cấu trúc của các hợp chất được xác định là: chrysophanol, α-tocopherol, 24-methylene-cycloartan-3β-ol, cyclolaudenol và nobiletin. Các hợp chất này đều là lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Drynaria.

O OCH3 H3CO

H3CO

OCH3

OCH3 2

4 3 6 5

7 8 9

1'2' 3' 5'4' 6'

Nobiletin

HO 2 1 3 4 5

6 7 9 8 10

1112 13 14

15 1716 18

20 21

22 23

24 25

28 29

24-Methylene-cycloartan-3β-ol

OH O OH

CH3

H HO

2 1 3 4 5

6 7 9 8 10

1112 13 14

1615 17 18

19 20

22 2324 25 26

27 30

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 35 .1 Xác định cấu trúc hợp chất DBH1

Phân lập các chất từ cao thô