M ĐẦU
3.3 Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarumVTCC 431, Lactobacillus
3.3.1 Xác định tỉ lệ vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 nhân giống trên môi trường MRS b sung vào nguyên liệu.
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, và Lactobacillus bulgaricus
VTCC 703 đƣợc nhân giống trên m i trƣờng RS. Sau đó tiến hành 18 mẫu thí nghiệm, m i chủng 9 mẫu, m i mẫu 30g đầu tôm theo thứ tự nhƣ sau: mẫu 1: không bổ sung dịch vi khuẩn, mẫu 2: bổ sung 2% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 3: bổ sung 4% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 4: bổ sung 6% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 5: bổ sung 8% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 6 bổ sung 10% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 7: bổ sung 12% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 8 bổ sung 14% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 9: bổ sung 16% (v/w) dịch vi khuẩn. Quá trình lên men thực hiện ở nhiệt độ phòng, trong 6 ngày, pH 7,2 và điều kiện kị khí.
Sau khi lên men ép tách vỏ, rửa sạch, cân, sấy khô đến độ ẩm 11 và tiến hành phân tích x c định hàm lƣợng protein, hàm lƣợng khoáng. Kết quả thể hiện ở bảng phụ lục 5, phụ lục 6 và hình 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.
Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng của chủng Lactobacillus plantarum VTCC 431 sau k t ay đ i nồng độ dịch vi khuẩn % ( v/w).
Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarumVTCC 431 sau k t ay đ i nồng độ dịch vi khuẩn % (
v/w).
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein của chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricusVTCC 703 sau k t ay đ i nồng độ dịch vi khuẩn % (
v/w).
Hình 3.6 Biểu đồ biểudiễn hiệu quả khử khoáng của chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricusVTCC 703 sau k t ay đ i nồng độ dịc v k uẩn
(v/w)
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Nhận xét: từ kết quả phân tích của hình cho thấy càng tăng tỷ lệ dịch vi khuẩn, lƣợng protein và khoáng còn lại trong vỏ đầu tôm càng thấp. Sau 6 ngày bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 nhân giống trên m i trƣờng MRS hàm lƣợng protein còn lại trong mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tƣơng ứng là: 30,22%; 27,08%; 23,19%; 20,73%; 16,62%; 13,29%; 12,50%; 12,05%; 11,29%và hàm lƣợng khoáng còn lại trong mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lần lƣợt là: 27,41%; 24,32%; 22,15%; 15,50%; 15,79%; 11,44%; 11,00%; 11,05%; 11,40%. Sau 6 ngày bổ sung vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703, nhân giống trên m i trƣờng RS hàm lƣợng protein còn lại trong mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tƣơng ứng là: 30,22%; 28,69%; 26,86%; 23,60%; 20,92%; 16,04%; 15,05%; 14,38%; 14,16% và hàm lƣợng khoáng còn lại trong mẫu lần lƣợt là: 27,41%; 25,13%; 23,75%; 20,72%; 17,78%; 14,75%; 14,90%; 14,20%; 14,60%.
Nhƣ vậy khi bổ sung dịch vi khuẩn ở tỷ lệ 10%, lƣợng protein và khoáng khử đƣợc nhiều nhất, khi tăng dịch vi khuẩn ở tỷ lệ 12%, 14%, 16% so với nguyên liệu thì kh ng làm thay đổi đ ng kể hiệu quả tách. Nhƣ vậy nồng độ vi khuẩn bổ
sung vào nguyên liệu ở 10% là tối ƣu cho qu trình xử lý protein và khoáng có trong nguyên liệu đầu tôm.
Đầu tôm sau quá trình lên men thì một phần protein và khoáng bị loại bỏ đó là nhờ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 đ sinh ra enzyme protease và acid lactic. Enzyme protease s thủy phân cắt đứt liên kết peptid trong mạch protein tạo thành các peptid mạch ngắn, các acid amin hòa tan vào dịch lên men. Còn acid lactic s phản ứng với CaCO3 tạo thành lactatcanxi ở dạng không hòa tan. Vì thế hàm lƣợng protein và khoáng còn lại trong đầu tôm giảm đ ng kể. Từ kết quả trên nhận thấy chọn tỷ lệ dịch vi khuẩn bổ sung vào nguyên liệu đầu tôm là 10% là hợp lý.
3.3.2 Xác định thời gian lên men khử protein và khử khoáng
Chuẩn bị 18 mẫu thí nghiệm, m i chủng 9 mẫu, m i mẫu 30g, bổ sung 10% (v/w) dịch vi khuẩn, điều chỉnh pH 7,2 và tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng với thời gian khác nhau: mẫu 1: lên men trong 72 giờ, mẫu 2: lên men trong 84 giờ, mẫu 3 lên men trong 96 giờ, mẫu 4: lên men trong 108 giờ, mẫu 5: lên men trong 120 giờ, mẫu 6: lên men trong 132 giờ, mẫu 7: lên men trong 144 giờ, mẫu 8: lên men trong 156 giờ, mẫu 9: lên men trong 168 giờ.
Sau khi lên men tiến hành ép t ch nƣớc, rửa sạch sấy kh đến cùng độ ẩm là 11%. Tiến hành phân tích hàm lƣợng protein, khoáng. Kết quả thể hiện ở bảng phụ lục 7, phụ lục 8 và hình 3.7, 3.8, 3.9, 3.10.
Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein của dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 sau k t ay đ i thời gian lên men (h)
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng của dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarumVTCC 431 sau k t ay đ i thời gian lên men (h).
Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein của dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricusVTCC 703 sau k t ay đ i thời gian lên men (h)
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng của dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 sau k t ay đ i thời gian lên men (h).
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Nhận xét: Kết quả phân tích cho thấy thời gian lên men có quan hệ nghịch biến với hàm lƣợng protein và kho ng sau qu trình lên men. Điều này có nghĩa là trong giới hạn nghiên cứu khi càng tăng thời gian lên men thì lƣợng protein và
khoáng còn lại trong đầu tôm sau quá trình lên men càng giảm. Nhƣng càng về cuối quá trình thì hiệu quả khử protein và kho ng kh ng đ ng kể. Cụ thể là từ 72 đến 132 giờ với dịch tỷ lệ vi khuẩn Latobacillus plantarum VTCC 431 là 10% (v/w) thì lƣợng protein giảm lần lƣợt là 22,02%; 21,06%; 17,35%; 13,41%; 12,02% và hàm lƣợng khoáng giảm lần lƣợt là: 29,23%; 26,83%; 20,86%; 16,67%; 14,39%; 13,1%. Với dịch tỉ lệ vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 là 10% (v/w) thì lƣợng protein giảm lần lƣợt là 28,57%; 26,15%; 23,37%, 21,81%; 18,66%; 18,23% và hàm lƣợng khoáng giảm lần lƣợt là: 28,03%; 26,68%; 24,50%; 21,74%; 18,85%; 14,65% nhƣng bắt đầu từ 144 giờ trở đi quả trình khử protein và t ch kho ng đ ổn định, lƣợng protein và khoáng bị khử kh ng đ ng kể. Do vậy để tiết kiệm thời gian mà hiệu quả khử protein và khoáng vẫn đạt đƣợc tối ƣu, nên chọn thời gian lên men là 132 giờ.
Từ kết quả phân tích trên ta rút ra th ng số tối ƣu cho qu trình khử kho ng và protein trên đầu t m bằng vi khuẩn lactic đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
ảng 3.2 T ng số tố ƣu c o qu tr n k ử k o ng và prote n bằng dịc v k uẩn
STT ố Th ng ố ối ƣ
1 Nồng độ dịch vi khuẩn phế liệu 10% (v/w)
2 Thời gian 132 giờ
3 pH 7,2
4 Nhiệt độ 370C
3.3.3 Xác định chế độ khử khoáng bằng HCl
3.3.3.1 Xác ịnh nồ g ộ HCl trong quá trình khử khoáng
Dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 trộn với đầu tôm sau khi lên men ở nhiệt độ phòng, kị khí, pH 7,2 tỷ lệ dịch vi khuẩn 10% (v/w) trong thời gian 132 giờ tiến hành ép tách nƣớc, rửa, cân. M i chủng vi khuẩn tiến hành 7 mẫu thí nghiệm. M i mẫu 2g
nguyên liệu, bổ sung dung dịch HCl vào các mẫu theo tỉ lệ 1:5 (w/v) với các nồng độ khác nhau: mẫu 1: 2,0% HCl; mẫu 2: 2,5% HCl; mẫu 3: 3,0% HCl; mẫu 4: 3,5% HCl; mẫu 5: 4,0% HCl; mẫu 6: 4,5 % HCl; mẫu 7: 5,0% HCl. Thời gian khử khoáng 17 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sau khi khử khoáng, rửa trung tính và sấy kh đến cùng độ ẩm là 11%, sau đó phân tích hàm lƣợng khoáng còn lại trong mẫu. Kết quả phân tích thể hiện ở bảng phụ lục 9 và hình 3.11, 3.12.
Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng còn lại của HCl k t ay đ i nồng độ (%) sau khi khử khoáng bằng dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum
VTCC 431
Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng còn lại của HCl k t ay đ i nồng độ (%) sau khi khử khoáng bằng dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus
VTCC 703
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Nhận xét: Kết quả phân tích ở hình cho thấy khi tăng nồng độ HCl dùng xử lý thì hàm lƣợng khoáng còn lại trong nguyên liệu đầu tôm giảm mạnh, khi nồng độ HCl từ 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0% hàm lƣợng khoáng còn lại sau khi khử khoáng bằng dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431trong nguyên liệu giảm lần lƣợt là 3,56%; 2,57%; 1,96%; 1,47%; 0,70% so với lƣợng kho ng ban đầu là 13,1%. Nhƣ vậy ở nồng độ 4,0 hàm lƣợng khoáng giảm từ 13,10% đến 0,70%. Hàm lƣợng khoáng còn lại sau khi khử khoáng bằng dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 tƣơng ứng với nồng độ HCl từ 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0% lần lƣợt là: 4,00%; 3,61%; 2,63%; 1,87%; 1,22%. Khi nồng độ HCl lớn hơn 4,0% hàm lƣợng khoáng trong nguyên liệu giảm rất ít và đi vào ổn định hiệu quả khử khoáng tăng kh ng đ ng kể. Nhƣ vậy để tiết kiệm hóa chất cũng nhƣ đảm bảo đƣợc chất lƣợng chitosan thành phẩm sau này đƣợc tốt nên chọn nồng độ HCl 4,0%.
3.3.3.2 X c định thời gian xử lý HCl trong khử khoáng.
Dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 trộn với đầu tôm sau khi lên men ở nhiệt độ phòng, kị khí,
pH 7,2 tỷ lệ vi khuẩn 10% trong thời gian 132 giờ tiến hành ép t ch nƣớc, rửa, cân. M i chủngchuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm. M i mẫu 2g nguyên liệu, bổ sung dung dịch HCl 4,0% vào các mẫu theo tỉ lệ 1:5 w/v, tiến hành khử khoáng ở nhiệt độ phòng với các khoảng thời gian khác nhau: mẫu 1: khử khoáng trong 14giờ, mẫu 2 khử khoáng trong 15giờ, mẫu 3 khử khoáng trong 16 giờ, mẫu 4 khử khoáng trong 17 giờ, mẫu 5 khử khoáng trong 18 giờ, mẫu 6 khử khoáng trong 19 giờ.
Sau khi khử khoáng, rửa trung tính và sấy kh đến cùng độ ẩm là 11,0%, sau đó phân tích hàm lƣợng khoáng còn lại trong mẫu. Kết quả phân tích thể hiện ở bảng phụ lục 10 và hình 3.13, 3.14.
Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng còn lại của HCl k t ay đ i thời gian (h) sau khi lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarumVTCC
431
Hình 3.14 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng còn lại của l k t ay đ i thời gian (h) sau khi lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC
703
Các chữ cái khác nhau sẽ biểuthị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Nhận xét: theo kết quả phân tích cho thấy cùng với nồng độ HCl 4,0%, thời gian khử kho ng càng kéo dài thì lƣợng khoáng khử đƣợc càng nhiều. Theo hình 3.7 và 3.8 khi tăng thời gian từ 14 đến 17 giờ thì quá trình khử khoáng xảy ra rất nhanh, lƣợng khoáng giảm tƣơng ứng từ 2,99% đến 0,47% đối với chủng
Lactobacillus plantarum VTCC 431. Lƣợng kho ng trong đầu tôm chỉ còn 0,47% sau 17 giờ khử khoáng so với lƣợng kho ng ban đầu là 13,1%. Đối với chủng
Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 lƣợng khoáng giảm từ 3,45% xuống còn 0,92 . ƣợng kho ng trong đầu tôm chỉ còn 0,92% so với lƣợng kho ng ban đầu là 14,65%. Sau 17 giờ trở đi lƣợng kho ng trong đầu tôm giảm kh ng đ ng kể. Thời gian ngắn thì quá trình khử khoáng s không triệt để, ngƣợc lại nếu thời gian dài thì s ảnh hƣởng đến chất lƣợng của chitin thành phẩm và không có lợi cho sản xuất thực tế. Nhƣ vậy thời gian thích hợp cho quá trình khử khoáng là 17 giờ.
Từ hình 3.11, 3.12, 3.13, 3.14 nếu muốn khử khoáng một cách triệt để ta phải tăng nồng độ HCl và thời gian thủy phân. Theo Hackman trong quy trình sản xuất chitin chitosan từ phế liệu vỏ t m thì c ng đoạn khử khoáng bằng HCl ảnh hƣởng nhiều nhất đến kích thƣớc và độ nhớt của chitosan thu đƣợc. Hackman quan sát thấy rằng hầu hết các sự suy giảm của chu i chitin xảy ra trong vài phút đầu tiên và các
sản phẩm hình thành đƣợc là oligosaccharide [24]. Từ đó cho thấy rằng, việc tăng các yếu tố trên s cho hiệu suất khử kho ng cao nhƣng s ảnh hƣởng xấu đến việc cắt mạch chitin và chitosan thu đƣợc sau này. Sự suy giảm mạch polysaccharide của chitin xảy ra thông qua việc acid HCl thủy phân cắt đứt liên kết glucoside (Be Miller, 1967) với cơ chế thêm proton vào oxy của liên kết glucoside và thêm nƣớc vào nhóm đƣờng khử cuối cùng (Edward, 1955). Sự suy giảm mạch polysaccharide của chitin xảy còn thông qua việc acid HCl thủy phân cắt đứt liên kết N-acetyl [22].
Vì vậy việc tăng cao nồng độ HCl và thời gian thủy phân phải đảm bảo hợp lý để tiết kiệm hóa chất và giảm thời gian thủy phân, từ đó giảm chi phí sản xuất nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc vấn đề quan trọng là các yếu tố trên kh ng t c động đến việc tách mạch polysaccharide của chitin.
Vậy thông số tối ƣu cho c ng đoạn khử khoáng còn lại đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3 Thông số tố ƣu c o c ng đoạn khử khoáng còn lại
STT Y u tố Thông số tối ƣ
1 Nồng độ HCl 4%
2 Thời gian 17h
3 Tỷ lệ phế liệu/dung dịch HCl 1/5
4 Nhiệt độ thủy phân 370C
3.3.4 Xác định chế độ khử protein bằng NaOH
3.3.4.1 Xác ịnh nồ g ộ NaOH trong khử protein sau lên men
Dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 trộn với đầu tôm sau khi lên men ở nhiệt độ phòng, kị khí, pH 7,2 tỷ lệ dịch vi khuẩn 10% (v/w) trong thời gian 132 giờ tiến hành ép tách nƣớc, rửa, cân. M i chủng chuẩn bị 7 mẫu thí nghiệm. M i mẫu 2g nguyên liệu, bổ sung NaOH vào các mẫu theo tỷ lệ 1/4 (w/v) với các nồng độ khác nhau: mẫu 1: NaOH 2,0%, mẫu 2: NaOH 2,5%, mẫu 3: NaOH 3,0%, mẫu 4: NaOH 3,5%, mẫu 5 NaOH 4,0%, mẫu 6: NaOH 4,5%, mẫu 7: NaOH 5,0%. Thời gian khử khoáng 12 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sau khi khử protein, rửa trung tính và sấy kh đến cùng độ ẩm là 11%, tiến hành phân tích hàm lƣợng protein có trong mẫu. Kết quả phân tích thể hiện ở bảng
phụ lục 3.11 và hình 3.15, 3.16.
Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein còn lại của NaOH khi thay đ i nồng độ (%) sau khi lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum
VTCC 431
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein còn lại của NaOH khi thay đ i nồng độ (%) sau khi lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus
VTCC 703
Nhận xét: kết quả phân tích ở hình cho thấy với cùng một lƣợng dung dịch NaOH, càng tăng nồng độ thì lƣợng protein bị thủy phân càng nhiềutheo quá trình thủy phân. Ở nồng độ NaOH từ 2,0% 4,0%, sau 12 giờ thủy phân, lƣợng protein đƣợc khử ngày càng tăng, hàm lƣợng protein còn lại tƣơng ứng là 2,49%; 2,47%; 1,95 ; 1,49 ; 0,74 . Đối với chủng Lactobacillus plantarum VTCC 431, còn đối với chủng Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 lƣợng protein còn lại tƣơng ứng là: 3,87%; 3,02%; 2,12%; 1,58%; 1,01%. Sau nồng độ từ 4,0% trở đi, lƣợng protein khử đƣợc không nhiều. Do vậy nồng độ NaOH thích hợp để khử protein còn lại sau lên men là 4,0%.
3.3.4.2 Xá ịnh th i gian khử protein sau lên men