M ĐẦU
2.1.2 Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Nguyên liệu đƣợc lấy trực tiếp tại bàn chế biến của công ty cổ phần Seafoods Nha Trang (F17). Nguyên liệu sau khi thu nhận đƣợc rửa sạch và chuyển ngay về phòng thí nghiệm để dùng cho quá trình nghiên cứu. Nguyên liệu đƣợc bảo quản đ ng ở tủ -200
C phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Trƣờng Đại học Nha Trang.
2.2 Phƣơng há nghiên ứu
2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu t m đƣợc thu tại phân xƣởng chế biến, công ty cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Nguyên liệu đƣợc bảo quản lạnh trong thùng xốp và chuyển về phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt để tránh một số biến đổi không mong muốn. Trƣớc khi tiến hành nghiên cứu,nguyên liệu đầu tôm đƣợc rửa sạch và xay nhỏ, tất cả các mẫu thí nghiệm đều đƣợc xay bởi cùng một thiết bị, kích thƣớc mẫu là khoảng từ 4 6 mm và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trƣờng hợp chƣa làm ngay thì rửa sạch, cân cho vào túi polymer (m i túi 200g), bảo quản đ ng ở điều kiện nhiệt độ -200
C.
2.2.2 Các phương pháp phân tích hóa học
2.2.2.1 Xác ị h h ng ẩm bằ g ph ơ g pháp sấy khô ở nhiệt ộ 1050C theo TCVN 3700 1990. Phụ lục 2
2.2.2.2 Xác ị h h ng khoáng bằ g ph ơ g pháp u g ở 5500C theo TCVN 4588 1988. Phụ lục 3
2.2.2.3 Xác ị h h ng protein còn lại bằ g ph ơ g pháp Microbiuret. Phụ lục 1
2.2.2.4 Xác ịnh hiệu suất khử khoáng và khử protein
Hiệu suất khử protein (DP (%)) và khử kho ng DA đƣợc x c định dựa trên công thức của Rao và cộng sự (2000)
DP (%) = [(P0*O) (PR*R)]*100/(P0*O) DA (%) = [(A0*O) (AR*R)]*100/(A0*O) Trong đó:
P0, PR: hàm lƣợng protein (g g tƣơng ứng của mẫu trƣớc và sau khi xử lý. A0, AR: hàm lƣợng kho ng g g tƣơng ứng của mẫu trƣớc và sau xử lý. O, R: khối lƣợng g tƣơng ứng của mẫu trƣớc và sau khi xử lý.
2.2.3 Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic đƣợc cung cấp bởi viện bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (VTCC) Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Chủng vi khuẩn lactic ở dạng bảo quản đ ng sâu -690C. Trƣớc khi sử dụng cần hoạt hóa và nhân giống theo quy trình:
Hình 2.1 Sơ đồ hoạt hóa hai chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC
431và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703
i trƣờng dinh dƣỡng sử dụng để hoạt hóa và nhân giống các chủng vi khuẩn lactic sử dụng trong nghiên cứu là MRS, thành phần m i trƣờng đƣợc thể hiện ở hụ ụ 13.
Hòa tan 55,15g m i trƣờng MRS tổng hợp với 1000ml nƣớc cất đem hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút. Nếu pha m i trƣờng RS đ c thì bổ sung thêm 20g agar lit m i trƣờng, hòa tan đều thạch agar rồi phân phối vào các bình tam giác, đem hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút.
Giống bảo quản tủ đ ng, r đ ng Hoạt hóa trên m i trƣờng
MRS agar (370C, 48h)
Sử dụng
Nhân giống trên m i trƣờng MRS lỏng (370C, lắc 150v/p,
13h)
Tăng sinh trên m i trƣờng MRS lỏng (370C, lắc 150v/p,
2.2.3.1 B trí thí nghiệm
Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu đ đƣợc thực hiện về sử dụng vi sinh trong quá trình sản xuất chitin và chitosan, dự kiến thí nghiệm trong nghiên cứu này đƣợc bổ sung nhƣ sau:
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm t ng qu t
Nguyên liệu vỏ đầu tôm rửa sạch và xay nhỏ, sau đó chia làm hai mẫu thí nghiệm: mẫu 1 trộn với chủng vi khuẩn Lactobacillus platarum VTCC 431, mẫu 2: trộn với Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 đ đƣợc nhân giống trƣớc đó theo các tỷ lệ khác nhau và thời gian kh c nhau để chọn đƣợc điều kiện tối ƣu cho việc
Vi khuẩn lactic
Nhân giống
Nguyên liệu đầu tôm
Rửa sạch Khử protein, khoáng Ép Vỏ tôm Dịch ép Rửa sạch Khử khoáng còn lại Rửa sạch Khử protein còn lại Rửa sạch Phơi Chitin Tỉ lệ vi khuẩn % (v/w) Thời gian ( ngày) pH X c định hàm lƣợng protein, khoáng Nồng độ HCl Thời gian xử lý Nồng độ NaOH Thời gian xử lý
khử khoáng và protein phù hợp nhất, bổ sung đệm phosphate (tỷ lệ 1:1). Tiến hành ép tách riêng phần dịch và phần vỏ. Một phần vỏ đem đi sấy kh đến độ ẩm 11 để x c định hàm lƣợng kho ng và hàm lƣợng protein còn lại. Phần còn lại rửa sạch và sử dụng để nghiên cứu các chế độ xử lý để sản xuất chitin nhƣ khử khoáng và khử lƣợng protein còn lại trong lên men. Phần dịch ép có thể sử dụng để sản xuất thức ăn gia súc.
2.2.3.2 Xác ịnh tỷ lệ vi khuẩn bổ sung
Vi khuẩn lactic đƣợc tăng sinh và nhân giống trên m i trƣờng dịch lỏng MRS sao cho mật độ tế bào khi đo OD ở bƣớc sóng 600 nm đạt đƣợc tối đa thì sử dụng bổ sung cho quá trình lên men khử khoáng và protein trong vỏ đầu tôm.
Bố trí thí nghiệm x c định tỷ lệ vi khuẩn lactic bổ sung theo sơ đồ ở hình 2.3. Trong đó, khảo sát khả năng khử khoáng và protein của chủng vi khuẩn
Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 vào nguyên liệu đầu tôm theo các tỷ lệ từ 0 16% (v/w). Thời gian lên men: 6 ngày, pH = 7,2 trong điều kiện nhiệt độ phòng. Sau thời gian lên men tiến hành x c định hàm lƣợng kho ng và protein để chọn tỉ lệ vi khuẩn bổ sung thích hợp.
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định tỷ lệ vi khuẩn
Nguyên liệu vỏ đầu tôm
Rửa
Cân
Bổ sung vi khuẩn lactic đ đƣợc nhân giống với tỷ lệ khác nhau Lên men ở pH 7,2; t0 phòng; 6 ngày Rửa trung tính Sấy khô X c định hàm lƣợng protein, hàm lƣợng khoáng Chọn tỷ lệ vi khuẩn thích hợp 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16%
2.2.3.3 Xác ịnh thời gian xử lý.
Bố trí thí nghiệm khử protein bằng chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum
VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 trong khoảng thời gian từ 72– 168 giờ theo sơ đồ hình 2.4, với các thông số nhƣ tỷ lệ bổ sung giống đ x c định ở thí nghiệm trƣớc, pH = 7,2 trong điều kiện nhiệt độ phòng.
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định thời gian xử lý vỏ đầu tôm bằng vi khuẩn lactic
2.2.3.4 Xác ịnh chế ộ khử khoáng bằng acid HCl
Mục đích của thí nghiệm này là x c định đƣợc nồng độ HCl và thời gian xử lý tốt nhất cho việc khử khoáng mà không làm ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng của
Nguyên liệu vỏ đầu tôm
Rửa
cân
Bổ sung vi khuẩn với tỉ lệ đ chọn; pH 7,2; t0 phòng và cho lên men ở thời gian khác nhau (giờ)
Rửa trung tính
Sấy khô
X c định hàm lƣợng protein, hàm lƣợng khoáng
Chọn thời gian lên men thích hợp
thành phẩm sau này. Đồng thời thí nghiệm này cũng nhằm x c định lƣợng hóa chất sử dụng cho quá trình khử khoáng còn lại trong nguyên liệu sau khi xử lý bằng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 từ đó x c định đƣợc lƣợng hóa chất tiết kiệm đƣợc.
Thí nghiệm x c định nồng độ acid HCl:
Bố trí thí nghiệm x c định nồng độ HCl sử dụng trong khử khoáng với một thông số cố định nhƣ: thời gian khử khoáng là 17h, tỷ lệ dung dịch/nguyên liệu tƣơi sau khi lên men là 5/1 (v/w) và tiến hành ở nhiệt độ phòng.
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định nồng độ axit HCl trong khử khoáng
Th ghiệ xác ị h thời gia xử ý axit HC :
Thời gian khử khoáng bằng axit HCl có ảnh hƣởng rất lớn đến hàm lƣợng khoáng còn lại cũng nhƣ qu trình hình thành chất lƣợng thành phẩm sau này.
Bố trí thí nghiệm x c định thời gian xử lý HCl trong khử kho ng theo sơ đồ trong hình 2.6. Một số thông số cố định nhƣ: tỉ lệ dung dịch/nguyên liệu tƣơi sau lên men là 5/1 (v/w), nhiệt độ phòng và nồng độ HCl tối ƣu ở thí nghiệm trƣớc đó.
5% Nguyên liệu sau khi lên
men Rửa sạch Cân Khử khoáng bằng HCl ở các nồng độ khác nhau trong 17h, t0 phòng; w/v là 1/5 2% 2,5% 3% 3,5% 4% 4,5% Rửa trung tính Sấy khô X c định hàm lƣợng khoáng Chọn nồng độ HCl thích hợp
Hình 2.6Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định thời gian xử lý axit HCl trong khử khoáng
2.2.3.5 Xác ịnh chế ộ khử protein còn lại bằ g NaOH ặc
Mục đích chính của thí nghiệm này là khử hết protein có trong nguyên liệu sau khi lên men. Sự có m t của protein s gây trở ngại cho phản ứng deacetyl sau này dẫn đến sự giảm chất lƣợng của thành phẩm. Ngoài ra để giúp cho việc sử dụng lại NaOH, quá trình khử protein cũng s tẩy bớt màu và hạn chế màu ở dung dịch NaOH đ c sau khi deacetyl.
19h Nguyên liệu sau khi lên
men Rửa sạch Nguyên liệu sau khi lên men
Rửa sạch Cân
Khử khoáng bằng HCl đ chọn với các khoảng thời gian khác nhau (giờ); w/v = 1/5; t0 phòng
13h 14h 15h 16h 17h 18h Rửa trung tính Sấy khô X c định khoáng Chọn thời gian thích hợp
X c định nồng độ NaOH trong khử protein sau khi lên men:
Bố trí thí nghiệm x c định nồng độ NaOH trong xử lý protein sau khi lên men
Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định nồng độ NaOH trong khử protein sau lên men
5% Nguyên liệu sau lên men
Rửa sạch
Cân
Khử protein còn lại bằng NaOH ở các nồng độ khác nhau trong 12 giờ; w/v = 1/4; t0 phòng
2% 2,5% 3% 3,5% 4% 4,5%
Rửa trung tính
Sấy khô
X c định hàm lƣợng protein Chọn nồng độ NaOH thích hợp
X c định thời gian khử protein sau lên men
Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định thời gian xử lý NaOH trong khử protein sau lên men
Phƣơng ph p đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ khi x c định nồng độ NaOH. Trong thí nghiệm này cũng tiến hành cố định thông số tỷ lệ dung dịch NaOH/nguyên liệu tƣơi là 4/1 (v/w), nhiệt độ phòng, nồng độ NaOH tối ƣu vừa tìm đƣợc.
Nguyên liệu sau lên men
Rửa sạch
Cân
Khử protein còn lại bằng NaOH đ chọn; t0 phòng; w/v là 1/4; với các khoảng thời gian khác nhau (giờ)
Rửa trung tính
Sấy khô
X c định độ ẩm, protein
Chọn thời gian khử protein thích hợp
2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu:
Các số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm excel 2007, ANOVA với giá trị của p<0,05 đƣợc xem là có ý nghĩa về m t thống kê.
Số liệu phân tích là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm song song với p=95%
2.3 Hóa chất và thi t bị
2.3.1 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đồ án pepton, casein, agar, BSA là hóa chất tinh khiết của Merck – Đức
Các hóa chất còn lại đều là hóa chất tinh khiết của Trung Quốc
2.3.2 Thiết bị
Sử dụng các thiết bị có trong phòng thí nghiệm: nồi hấp, box cấy, tủ nung, tủ sấy, m y đo UV Vis, ...
ƢƠNG 3
KẾT QUẢ NG I N U V T ẢO U N 3.1 Th nh hần h họ ơ ản ầ h h n ng
Thành phần hóa học cơ bản của đầu t m thẻ chân trắng đƣợc phân tích và kết quả trình bày ở bảng 3.1. ảng 3.1 T àn p ần a ọc của đầu t m t c n tr ng Chỉ iê H ƣ ng Hàm lƣợng protein 48,08 1,4 Hàm lƣợng kho ng 30,21 1,9 Hàm lƣợng lipid 11,63 1,7 Chitin (%) 10,08 1,5 * ết u t h the h g chất h tu ệt i.
Đầu t m chứa 4 thành phần chính là protein, kho ng, lipid và chitin. Trong đó protein chiếm hàm lƣợng lớn nhất, gần 50 . So với kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ đầu t m thẻ chân trắng của Trang Sĩ Trung [16], cho thấy hàm lƣợng protein thu đƣợc ở đầu vỏ t m ít hơn 47,4 so với chỉ thu hồi lƣợng protein có ở đầu t m trong nghiên cứu (48,08 , vì lƣợng protein có ở vỏ rất thấp mà chủ yếu có ở phần thịt ở đầu t m. Hàm lƣợng lipid ở phần đầu 11,63 cũng cao hơn nhiều so với hàm lƣợng lipid thu hồi ở phần vỏ 4,7 , vì lipid có nhiều ở phần nội tạng tập trung trên đầu và có cả trong khối thịt ở phần đầu t m. Ngƣợc lại với hàm lƣợng protein và lipid thì chitin thu đƣợc ở vỏ t m 18,3 cao hơn chitin thu ở phần đầu.
3.2 Tăng inh và k t thúc th i gian nhân giống
Chủng giống Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 sau khi r đ ng tiến hành hoạt hóa trên m i trƣờng MRS agar, tiến hành phân lập chọn các khuẩn lạc đ c trƣng cho Lactobacillus plantarum
VTCC 431 nhƣ khuẩn lạc tròn, nhẵn, mịn, màu trắng sữa. Quan sát vi khuẩn
Lactobacillus plantarum VTCC 431 dƣới kính hiểu vi nhận thấy Lactobacillus plantarum VTCC 431 là trực khuẩn gram dƣơng, có dạng hình que nhỏ, không sinh bào tử, kh ng di động. Khuẩn lạc đ c trƣng cho Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 phẳng, hơi vàng, đƣờng kính 2 3 mm, khuẩn lạc càng già thì càng trở nên sậm màu. Quan sát vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 dƣới kính hiển vi nhận thấy Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 là trực khuẩn gram dƣơng, hình que dài, mảnh, thƣờng xếp thành chu i dài từ 5 20 μm, kh ng có khả năng di động.Tiến hành nhân giống trên m i trƣờng MRS lỏng và tiến hành lắc 150 vòng/phút.
Sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 giờ, lấy mẫu đo độ đục, kết quả thể hiện ở bảng phụ lục 4, hình 3.1 và hình 3.2.
Hình 3.1 Sự t ay đ độ đục của m trƣờng nuôi cấy theo thời gian của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2 4 6 8 10 11 12 13 14 16 18 20 22 24 26 28 30 k et qu a do OD thoi gian (h)
Hình 3.2 Sự t ay đ độ đục của môi trƣờng nuôi cấy theo thời gian của chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703.
Nhận xét: kết quả ở hình thí nghiệm cho thấy trong 8 giờ đầu vi khuẩn gần nhƣ ph t triển rất kém. Bắt đầu từ giờ thứ 10 trở đi, vi khuẩn bắt đầu phát triển rất nhanh thể hiện ở m i trƣờng nuôi cấy trở nên đục dần, vào khoảng 13 giờ đến 18 giờ, m i trƣờng đục nhất, tế bào đang ở cuối pha log đầu pha ổn định. Đây là lúc vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme nhiều nhất và có hoạt tính cao. Sau 20 giờ nuôi cấy vi khuẩn gần nhƣ không phát triển thêm vì vi khuẩn đang ở pha ổn định. Vì thế để tiết kiệm thời gian nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc tiêu chuẩn thì ta nên kết thúc và thu lấy tế bào tiêu chuẩn ở khoảng 13 18h.
Sau khi nuôi vi khuẩn 13 giờ, kiểm tra dịch nuôi vi khuẩn bằng cách hút 0,1ml dịch vi khuẩn đem cấy trang trên m i trƣờng MRS agar để trong tủ ấm. Sau 24 giờ lấy ra quan sát thấy vi khuẩn mọc đều, to và không có khuẩn lạc lạ. Chứng tỏ quá trình nhân giống đạt yêu cầu.
Sử dụng giống nhân theo quy trình trên trong quá trình lên men khử protein và khoáng ở đầu tôm.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0 2 4 6 8 10 11 12 13 14 16 18 20 22 24 26 28 30 ket qua do OD thoi gian (h)
3.3 Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 trong xử lý ầu tôm bulgaricus VTCC 703 trong xử lý ầu tôm
3.3.1 Xác định tỉ lệ vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 nhân giống trên môi trường MRS b sung vào nguyên liệu.
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, và Lactobacillus bulgaricus
VTCC 703 đƣợc nhân giống trên m i trƣờng RS. Sau đó tiến hành 18 mẫu thí nghiệm, m i chủng 9 mẫu, m i mẫu 30g đầu tôm theo thứ tự nhƣ sau: mẫu 1: không bổ sung dịch vi khuẩn, mẫu 2: bổ sung 2% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 3: bổ sung 4% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 4: bổ sung 6% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 5: bổ sung 8% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 6 bổ sung 10% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 7: bổ sung 12% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 8 bổ sung 14% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 9: bổ sung 16% (v/w) dịch vi khuẩn. Quá trình lên men thực hiện ở nhiệt độ phòng, trong 6 ngày, pH 7,2 và điều kiện kị khí.
Sau khi lên men ép tách vỏ, rửa sạch, cân, sấy khô đến độ ẩm 11 và tiến