M ĐẦU
2.3.2 Thiết bị
Sử dụng các thiết bị có trong phòng thí nghiệm: nồi hấp, box cấy, tủ nung, tủ sấy, m y đo UV Vis, ...
ƢƠNG 3
KẾT QUẢ NG I N U V T ẢO U N 3.1 Th nh hần h họ ơ ản ầ h h n ng
Thành phần hóa học cơ bản của đầu t m thẻ chân trắng đƣợc phân tích và kết quả trình bày ở bảng 3.1. ảng 3.1 T àn p ần a ọc của đầu t m t c n tr ng Chỉ iê H ƣ ng Hàm lƣợng protein 48,08 1,4 Hàm lƣợng kho ng 30,21 1,9 Hàm lƣợng lipid 11,63 1,7 Chitin (%) 10,08 1,5 * ết u t h the h g chất h tu ệt i.
Đầu t m chứa 4 thành phần chính là protein, kho ng, lipid và chitin. Trong đó protein chiếm hàm lƣợng lớn nhất, gần 50 . So với kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ đầu t m thẻ chân trắng của Trang Sĩ Trung [16], cho thấy hàm lƣợng protein thu đƣợc ở đầu vỏ t m ít hơn 47,4 so với chỉ thu hồi lƣợng protein có ở đầu t m trong nghiên cứu (48,08 , vì lƣợng protein có ở vỏ rất thấp mà chủ yếu có ở phần thịt ở đầu t m. Hàm lƣợng lipid ở phần đầu 11,63 cũng cao hơn nhiều so với hàm lƣợng lipid thu hồi ở phần vỏ 4,7 , vì lipid có nhiều ở phần nội tạng tập trung trên đầu và có cả trong khối thịt ở phần đầu t m. Ngƣợc lại với hàm lƣợng protein và lipid thì chitin thu đƣợc ở vỏ t m 18,3 cao hơn chitin thu ở phần đầu.
3.2 Tăng inh và k t thúc th i gian nhân giống
Chủng giống Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 sau khi r đ ng tiến hành hoạt hóa trên m i trƣờng MRS agar, tiến hành phân lập chọn các khuẩn lạc đ c trƣng cho Lactobacillus plantarum
VTCC 431 nhƣ khuẩn lạc tròn, nhẵn, mịn, màu trắng sữa. Quan sát vi khuẩn
Lactobacillus plantarum VTCC 431 dƣới kính hiểu vi nhận thấy Lactobacillus plantarum VTCC 431 là trực khuẩn gram dƣơng, có dạng hình que nhỏ, không sinh bào tử, kh ng di động. Khuẩn lạc đ c trƣng cho Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 phẳng, hơi vàng, đƣờng kính 2 3 mm, khuẩn lạc càng già thì càng trở nên sậm màu. Quan sát vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 dƣới kính hiển vi nhận thấy Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 là trực khuẩn gram dƣơng, hình que dài, mảnh, thƣờng xếp thành chu i dài từ 5 20 μm, kh ng có khả năng di động.Tiến hành nhân giống trên m i trƣờng MRS lỏng và tiến hành lắc 150 vòng/phút.
Sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 giờ, lấy mẫu đo độ đục, kết quả thể hiện ở bảng phụ lục 4, hình 3.1 và hình 3.2.
Hình 3.1 Sự t ay đ độ đục của m trƣờng nuôi cấy theo thời gian của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2 4 6 8 10 11 12 13 14 16 18 20 22 24 26 28 30 k et qu a do OD thoi gian (h)
Hình 3.2 Sự t ay đ độ đục của môi trƣờng nuôi cấy theo thời gian của chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703.
Nhận xét: kết quả ở hình thí nghiệm cho thấy trong 8 giờ đầu vi khuẩn gần nhƣ ph t triển rất kém. Bắt đầu từ giờ thứ 10 trở đi, vi khuẩn bắt đầu phát triển rất nhanh thể hiện ở m i trƣờng nuôi cấy trở nên đục dần, vào khoảng 13 giờ đến 18 giờ, m i trƣờng đục nhất, tế bào đang ở cuối pha log đầu pha ổn định. Đây là lúc vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme nhiều nhất và có hoạt tính cao. Sau 20 giờ nuôi cấy vi khuẩn gần nhƣ không phát triển thêm vì vi khuẩn đang ở pha ổn định. Vì thế để tiết kiệm thời gian nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc tiêu chuẩn thì ta nên kết thúc và thu lấy tế bào tiêu chuẩn ở khoảng 13 18h.
Sau khi nuôi vi khuẩn 13 giờ, kiểm tra dịch nuôi vi khuẩn bằng cách hút 0,1ml dịch vi khuẩn đem cấy trang trên m i trƣờng MRS agar để trong tủ ấm. Sau 24 giờ lấy ra quan sát thấy vi khuẩn mọc đều, to và không có khuẩn lạc lạ. Chứng tỏ quá trình nhân giống đạt yêu cầu.
Sử dụng giống nhân theo quy trình trên trong quá trình lên men khử protein và khoáng ở đầu tôm.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0 2 4 6 8 10 11 12 13 14 16 18 20 22 24 26 28 30 ket qua do OD thoi gian (h)
3.3 Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 trong xử lý ầu tôm bulgaricus VTCC 703 trong xử lý ầu tôm
3.3.1 Xác định tỉ lệ vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 nhân giống trên môi trường MRS b sung vào nguyên liệu.
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, và Lactobacillus bulgaricus
VTCC 703 đƣợc nhân giống trên m i trƣờng RS. Sau đó tiến hành 18 mẫu thí nghiệm, m i chủng 9 mẫu, m i mẫu 30g đầu tôm theo thứ tự nhƣ sau: mẫu 1: không bổ sung dịch vi khuẩn, mẫu 2: bổ sung 2% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 3: bổ sung 4% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 4: bổ sung 6% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 5: bổ sung 8% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 6 bổ sung 10% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 7: bổ sung 12% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 8 bổ sung 14% (v/w) dịch vi khuẩn, mẫu 9: bổ sung 16% (v/w) dịch vi khuẩn. Quá trình lên men thực hiện ở nhiệt độ phòng, trong 6 ngày, pH 7,2 và điều kiện kị khí.
Sau khi lên men ép tách vỏ, rửa sạch, cân, sấy khô đến độ ẩm 11 và tiến hành phân tích x c định hàm lƣợng protein, hàm lƣợng khoáng. Kết quả thể hiện ở bảng phụ lục 5, phụ lục 6 và hình 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.
Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng của chủng Lactobacillus plantarum VTCC 431 sau k t ay đ i nồng độ dịch vi khuẩn % ( v/w).
Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarumVTCC 431 sau k t ay đ i nồng độ dịch vi khuẩn % (
v/w).
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein của chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricusVTCC 703 sau k t ay đ i nồng độ dịch vi khuẩn % (
v/w).
Hình 3.6 Biểu đồ biểudiễn hiệu quả khử khoáng của chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricusVTCC 703 sau k t ay đ i nồng độ dịc v k uẩn
(v/w)
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Nhận xét: từ kết quả phân tích của hình cho thấy càng tăng tỷ lệ dịch vi khuẩn, lƣợng protein và khoáng còn lại trong vỏ đầu tôm càng thấp. Sau 6 ngày bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 nhân giống trên m i trƣờng MRS hàm lƣợng protein còn lại trong mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tƣơng ứng là: 30,22%; 27,08%; 23,19%; 20,73%; 16,62%; 13,29%; 12,50%; 12,05%; 11,29%và hàm lƣợng khoáng còn lại trong mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lần lƣợt là: 27,41%; 24,32%; 22,15%; 15,50%; 15,79%; 11,44%; 11,00%; 11,05%; 11,40%. Sau 6 ngày bổ sung vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703, nhân giống trên m i trƣờng RS hàm lƣợng protein còn lại trong mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tƣơng ứng là: 30,22%; 28,69%; 26,86%; 23,60%; 20,92%; 16,04%; 15,05%; 14,38%; 14,16% và hàm lƣợng khoáng còn lại trong mẫu lần lƣợt là: 27,41%; 25,13%; 23,75%; 20,72%; 17,78%; 14,75%; 14,90%; 14,20%; 14,60%.
Nhƣ vậy khi bổ sung dịch vi khuẩn ở tỷ lệ 10%, lƣợng protein và khoáng khử đƣợc nhiều nhất, khi tăng dịch vi khuẩn ở tỷ lệ 12%, 14%, 16% so với nguyên liệu thì kh ng làm thay đổi đ ng kể hiệu quả tách. Nhƣ vậy nồng độ vi khuẩn bổ
sung vào nguyên liệu ở 10% là tối ƣu cho qu trình xử lý protein và khoáng có trong nguyên liệu đầu tôm.
Đầu tôm sau quá trình lên men thì một phần protein và khoáng bị loại bỏ đó là nhờ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 đ sinh ra enzyme protease và acid lactic. Enzyme protease s thủy phân cắt đứt liên kết peptid trong mạch protein tạo thành các peptid mạch ngắn, các acid amin hòa tan vào dịch lên men. Còn acid lactic s phản ứng với CaCO3 tạo thành lactatcanxi ở dạng không hòa tan. Vì thế hàm lƣợng protein và khoáng còn lại trong đầu tôm giảm đ ng kể. Từ kết quả trên nhận thấy chọn tỷ lệ dịch vi khuẩn bổ sung vào nguyên liệu đầu tôm là 10% là hợp lý.
3.3.2 Xác định thời gian lên men khử protein và khử khoáng
Chuẩn bị 18 mẫu thí nghiệm, m i chủng 9 mẫu, m i mẫu 30g, bổ sung 10% (v/w) dịch vi khuẩn, điều chỉnh pH 7,2 và tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng với thời gian khác nhau: mẫu 1: lên men trong 72 giờ, mẫu 2: lên men trong 84 giờ, mẫu 3 lên men trong 96 giờ, mẫu 4: lên men trong 108 giờ, mẫu 5: lên men trong 120 giờ, mẫu 6: lên men trong 132 giờ, mẫu 7: lên men trong 144 giờ, mẫu 8: lên men trong 156 giờ, mẫu 9: lên men trong 168 giờ.
Sau khi lên men tiến hành ép t ch nƣớc, rửa sạch sấy kh đến cùng độ ẩm là 11%. Tiến hành phân tích hàm lƣợng protein, khoáng. Kết quả thể hiện ở bảng phụ lục 7, phụ lục 8 và hình 3.7, 3.8, 3.9, 3.10.
Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein của dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 sau k t ay đ i thời gian lên men (h)
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng của dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarumVTCC 431 sau k t ay đ i thời gian lên men (h).
Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử protein của dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricusVTCC 703 sau k t ay đ i thời gian lên men (h)
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng của dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 sau k t ay đ i thời gian lên men (h).
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Nhận xét: Kết quả phân tích cho thấy thời gian lên men có quan hệ nghịch biến với hàm lƣợng protein và kho ng sau qu trình lên men. Điều này có nghĩa là trong giới hạn nghiên cứu khi càng tăng thời gian lên men thì lƣợng protein và
khoáng còn lại trong đầu tôm sau quá trình lên men càng giảm. Nhƣng càng về cuối quá trình thì hiệu quả khử protein và kho ng kh ng đ ng kể. Cụ thể là từ 72 đến 132 giờ với dịch tỷ lệ vi khuẩn Latobacillus plantarum VTCC 431 là 10% (v/w) thì lƣợng protein giảm lần lƣợt là 22,02%; 21,06%; 17,35%; 13,41%; 12,02% và hàm lƣợng khoáng giảm lần lƣợt là: 29,23%; 26,83%; 20,86%; 16,67%; 14,39%; 13,1%. Với dịch tỉ lệ vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 là 10% (v/w) thì lƣợng protein giảm lần lƣợt là 28,57%; 26,15%; 23,37%, 21,81%; 18,66%; 18,23% và hàm lƣợng khoáng giảm lần lƣợt là: 28,03%; 26,68%; 24,50%; 21,74%; 18,85%; 14,65% nhƣng bắt đầu từ 144 giờ trở đi quả trình khử protein và t ch kho ng đ ổn định, lƣợng protein và khoáng bị khử kh ng đ ng kể. Do vậy để tiết kiệm thời gian mà hiệu quả khử protein và khoáng vẫn đạt đƣợc tối ƣu, nên chọn thời gian lên men là 132 giờ.
Từ kết quả phân tích trên ta rút ra th ng số tối ƣu cho qu trình khử kho ng và protein trên đầu t m bằng vi khuẩn lactic đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
ảng 3.2 T ng số tố ƣu c o qu tr n k ử k o ng và prote n bằng dịc v k uẩn
STT ố Th ng ố ối ƣ
1 Nồng độ dịch vi khuẩn phế liệu 10% (v/w)
2 Thời gian 132 giờ
3 pH 7,2
4 Nhiệt độ 370C
3.3.3 Xác định chế độ khử khoáng bằng HCl
3.3.3.1 Xác ịnh nồ g ộ HCl trong quá trình khử khoáng
Dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 trộn với đầu tôm sau khi lên men ở nhiệt độ phòng, kị khí, pH 7,2 tỷ lệ dịch vi khuẩn 10% (v/w) trong thời gian 132 giờ tiến hành ép tách nƣớc, rửa, cân. M i chủng vi khuẩn tiến hành 7 mẫu thí nghiệm. M i mẫu 2g
nguyên liệu, bổ sung dung dịch HCl vào các mẫu theo tỉ lệ 1:5 (w/v) với các nồng độ khác nhau: mẫu 1: 2,0% HCl; mẫu 2: 2,5% HCl; mẫu 3: 3,0% HCl; mẫu 4: 3,5% HCl; mẫu 5: 4,0% HCl; mẫu 6: 4,5 % HCl; mẫu 7: 5,0% HCl. Thời gian khử khoáng 17 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sau khi khử khoáng, rửa trung tính và sấy kh đến cùng độ ẩm là 11%, sau đó phân tích hàm lƣợng khoáng còn lại trong mẫu. Kết quả phân tích thể hiện ở bảng phụ lục 9 và hình 3.11, 3.12.
Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng còn lại của HCl k t ay đ i nồng độ (%) sau khi khử khoáng bằng dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum
VTCC 431
Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng còn lại của HCl k t ay đ i nồng độ (%) sau khi khử khoáng bằng dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus
VTCC 703
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Nhận xét: Kết quả phân tích ở hình cho thấy khi tăng nồng độ HCl dùng xử lý thì hàm lƣợng khoáng còn lại trong nguyên liệu đầu tôm giảm mạnh, khi nồng độ HCl từ 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0% hàm lƣợng khoáng còn lại sau khi khử khoáng bằng dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431trong nguyên liệu giảm lần lƣợt là 3,56%; 2,57%; 1,96%; 1,47%; 0,70% so với lƣợng kho ng ban đầu là 13,1%. Nhƣ vậy ở nồng độ 4,0 hàm lƣợng khoáng giảm từ 13,10% đến 0,70%. Hàm lƣợng khoáng còn lại sau khi khử khoáng bằng dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 tƣơng ứng với nồng độ HCl từ 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0% lần lƣợt là: 4,00%; 3,61%; 2,63%; 1,87%; 1,22%. Khi nồng độ HCl lớn hơn 4,0% hàm lƣợng khoáng trong nguyên liệu giảm rất ít và đi vào ổn định hiệu quả khử khoáng tăng kh ng đ ng kể. Nhƣ vậy để tiết kiệm hóa chất cũng nhƣ đảm bảo đƣợc chất lƣợng chitosan thành phẩm sau này đƣợc tốt nên chọn nồng độ HCl 4,0%.
3.3.3.2 X c định thời gian xử lý HCl trong khử khoáng.
Dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 trộn với đầu tôm sau khi lên men ở nhiệt độ phòng, kị khí,
pH 7,2 tỷ lệ vi khuẩn 10% trong thời gian 132 giờ tiến hành ép t ch nƣớc, rửa, cân. M i chủngchuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm. M i mẫu 2g nguyên liệu, bổ sung dung dịch HCl 4,0% vào các mẫu theo tỉ lệ 1:5 w/v, tiến hành khử khoáng ở nhiệt độ phòng với các khoảng thời gian khác nhau: mẫu 1: khử khoáng trong 14giờ, mẫu 2 khử khoáng trong 15giờ, mẫu 3 khử khoáng trong 16 giờ, mẫu 4 khử khoáng trong 17 giờ, mẫu 5 khử khoáng trong 18 giờ, mẫu 6 khử khoáng trong 19 giờ.
Sau khi khử khoáng, rửa trung tính và sấy kh đến cùng độ ẩm là 11,0%, sau đó phân tích hàm lƣợng khoáng còn lại trong mẫu. Kết quả phân tích thể hiện ở bảng phụ lục 10 và hình 3.13, 3.14.
Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng còn lại của HCl k t ay đ i thời gian (h) sau khi lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarumVTCC
431
Hình 3.14 Biểu đồ biểu diễn hiệu quả khử khoáng còn lại của l k t ay đ i thời gian (h) sau khi lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC
703
Các chữ cái khác nhau sẽ biểuthị sự hác hau có ý ghĩa về mặt th ng kê.
Nhận xét: theo kết quả phân tích cho thấy cùng với nồng độ HCl 4,0%, thời gian khử kho ng càng kéo dài thì lƣợng khoáng khử đƣợc càng nhiều. Theo hình 3.7 và 3.8 khi tăng thời gian từ 14 đến 17 giờ thì quá trình khử khoáng xảy ra rất nhanh, lƣợng khoáng giảm tƣơng ứng từ 2,99% đến 0,47% đối với chủng
Lactobacillus plantarum VTCC 431. Lƣợng kho ng trong đầu tôm chỉ còn 0,47%