3.3.1. Phương pháp DPPH
Tiến hành thực hiện theo các bước cụ thể như đã mô tả trong phần 2.3.3.1., khả năng đánh bắt gốc tự do (S%) được tính như sau:
Ast S (%) = 100 x (1 – )
Act
Ast : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm t = 5 phút (As5), 30 phút (As30) Act : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm t = 5 phút, 30 phút
S5 (%): khả năng đánh bắt gốc tự do sau 5 phút S30(%): khả năng đánh bắt gốc tự do sau 30 phút
Các chất thử nghiệm được tiến hành cùng với vitamin C (ký hiệu FC) và BHT (ký hiệu FB) làm chất so sánh.
Bảng 3.7 Kết quả khả năng đánh bắt gốc tự do của các dẫn chất chrysin (Các chất được ký hiệu như trong bảng 2.1 và 2.2)
STT Ký hiệu As5 S5 (%) As30 S30 (%) 1 F1 0,186 1,1 0,184 2,1 2 F2 0,179 4,8 0,175 6,9 3 F3 0,186 1,1 0,185 1,6 4 F4 0,179 4,8 0,176 6,4 5 F5 0,018 90,4 0,009 95,2 6 F6 0,017 91,0 0,009 95,2 7 F7 0,015 92,0 0,002 98,9 8 F8 0,163 13,3 0,159 15,4 9 F9 0,063 66,5 0,025 86,7 10 F10 0,187 0,5 0,186 1,1 11 F11 0,184 2,1 0,184 2,1 12 F12 0,186 1,1 0,184 2,1 13 F13 0,179 4,8 0,175 6,9 14 F14 0,183 2,7 0,182 3,2 15 F15 0,181 3,7 0,178 5,3 16 F16 0,019 89,9 0,011 94,1 17 F17 0,161 14,4 0,156 17,0 18 F18 0,183 2,7 0,181 3,7 19 F19 0,185 1,6 0,183 2,7 20 F20 0,186 1,1 0,180 4,3 21 F21 0,187 0,5 0,182 3,3 22 F22 0,183 2,7 0,181 3,7 23 F23 0,187 0,5 0,185 1,6 24 F24 0,181 3,7 0,181 3,7 25 F25 0,185 1,6 0,183 2,7 26 F26 0,184 2,1 0,182 3,2
27 F27 0,143 23,9 0,134 28,7 28 F28 0,184 2,1 0,183 2,7 29 F29 0,188 0,0 0,185 1,6 30 F30 0,014 92,6 0,003 98,4 31 F31 0,186 1,1 0,186 1,1 32 F32 0,183 2,7 0,182 3,2 33 F33 0,180 4,3 0,177 5,9 34 F34 0,179 4,8 0,178 5,3 35 F35 0,177 5,9 0,175 6,9 36 F36 0,048 74,5 0,031 83,5 37 F37 0,171 9,0 0,169 10,1 38 F38 0,183 2,7 0,177 5,9 39 F39 0,176 6,4 0,176 6,4 40 F40 0,186 1,1 0,183 2,7 41 F41 0,186 1,1 0,184 2,1 42 F42 0,180 4,3 0,180 4,3 43 F43 0,186 1,1 0,183 2,7 44 F44 0,182 3,2 0,179 4,8 45 F45 0,180 4,3 0,178 5,3 46 F46 0,177 5,9 0,174 7,4 47 F47 0,176 6,4 0,173 8,0 48 F48 0,182 3,2 0,181 3,7 49 FC 0,014 92,6 0,004 97,9 50 FB 0,013 93,1 0,004 97,9
Trong các dẫn chất nghiên cứu có 8 chất có khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH là F5, F6, F7, F9, F16, F27, F30, F36; trong đó:
- 5 chất có khả năng này rất cao là F5, F6, F7, F16, F30 (đều từ mức trên 90% sau 5 phút, và trên 94% sau 30 phút), tương đương với vitamin C (92,6% sau 5 phút và 97,9% sau 30 phút) và BHT (93,1% sau 5 phút và 97,9% sau 30 phút).
- Ở F9, F36 tác dụng có thấp hơn nhưng vẫn ở mức cao (ở F9 sau 5 phút là 66,5% và sau 30 phút là 86,7% còn ở F36 sau 5 phút là 74,5% và sau 30 phút là 83,5%). - Ở F27 khả năng này thấp hơn nhiều ( 23,9 % sau 5 phút và 28,7% sau 30 phút).
- Các chất còn lại gần như ở mức rất thấp và không có tác dụng.
Ở những chất có tác dụng bắt giữ gốc tự do, tốc độ này xảy ra rất nhanh, kết quả không có sự khác biệt lớn giữa 2 mức thời gian là 5 phút và 30 phút.
3.3.2. Phương pháp mô hình beta-caroten-acid linoleic
Tiến hành thực hiện theo các bước cụ thể như đã mô tả trong phần 2.3.3.2., Hoạt tính chống oxy hóa T (%) được tính như sau:
As0 – Ast T (%) = 100 x (1 – )
Ac0 – Act
As0 : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm 0 phút
Ast : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm t = 60 phút, 120 phút Ac0 : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm 0 phút
Act : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm t = 60 phút (Ac60), 120 phút (Ac120) Ac0 = 0,672; Ac60 = 0,133; Ac120 = 0,016.
Các chất thử nghiệm được tiến hành cùng với BHT (2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4- methylphenol (làm chất so sánh), ký hiệu FB.
Bảng 3.8 Kết quả hoạt tính chống oxy hóa của các dẫn chất chrysin (Các chất được ký hiệu như trong bảng 2.1 và 2.2)
STT Ký hiệu As0 As60 T (%) As120 T (%) 1 F1 0,702 0,289 23,4 0,031 -2,3 2 F2 0,667 0,181 9,8 0,046 5,3 3 F3 0,683 0,158 2,6 0,047 3,0 4 F4 0,717 0,278 18,6 0,089 4,3 5 F5 0,689 0,430 51,9 0,204 26,1 6 F6 0,667 0,475 64,4 0,360 53,2 7 F7 0,702 0,550 71,8 0,492 68,0 8 F8 0,700 0,254 17,3 0,092 7,3 9 F9 0,684 0,214 12,8 0,080 7,9 10 F10 0,671 0,145 2,4 0,020 0,8 11 F11 0,701 0,201 7,2 0,058 2,0 12 F12 0,702 0,159 -0,7 0,040 -0,9
13 F13 0,681 0,155 2,4 0,038 2,0 14 F14 0,689 0,183 6,1 0,041 1,2 15 F15 0,683 0,165 3,9 0,032 0,8 16 F16 0,700 0,460 55,5 0,203 24,2 17 F17 0,671 0,179 8,7 0,061 7,0 18 F18 0,703 0,219 10,2 0,011 -5,5 19 F19 0,708 0,181 2,2 0,054 0,3 20 F20 0,699 0,301 26,2 0,061 2,7 21 F21 0,682 0,204 11,3 0,069 6,6 22 F22 0,668 0,288 29,5 0,038 4,0 23 F23 0,701 0,220 10,8 0,064 2,9 24 F24 0,682 0,216 13,5 0,031 0,8 25 F25 0,687 0,155 1,3 0,045 2,1 26 F26 0,681 0,201 10,9 0,048 3,5 27 F27 0,718 0,203 4,5 0,034 -4,3 28 F28 0,668 0,184 10,2 0,070 8,8 29 F29 0,697 0,198 7,4 0,065 3,7 30 F30 0,699 0,362 37,5 0,187 22,0 31 F31 0,687 0,203 10,2 0,064 5,0 32 F32 0,689 0,192 7,8 0,062 4,4 33 F33 0,669 0,198 12,6 0,031 2,7 34 F34 0,701 0,176 2,6 0,018 -4,1 35 F35 0,708 0,183 2,6 0,025 -4,1 36 F36 0,701 0,368 38,2 0,167 18,6 37 F37 0,698 0,204 8,3 0,056 2,1 38 F38 0,658 0,161 7,8 0,009 1,1 39 F39 0,685 0,198 9,6 0,031 0,3 40 F40 0,708 0,188 3,5 0,062 1,5 41 F41 0,681 0,179 6,9 0,050 3,8 42 F42 0,677 0,174 6,7 0,009 -1,8 43 F43 0,691 0,182 5,6 0,017 -2,7 44 F44 0,678 0,145 1,1 0,022 0,0 45 F45 0,695 0,156 0,0 0,018 -3,2 46 F46 0,688 0,144 -0,9 0,008 -3,7 47 F47 0,688 0,140 -1,7 0,013 -2,9
48 F48 0,667 0,152 4,5 0,009 -0,3
49 FB 0,682 0,673 98,3 0,660 96,6
Sau 60 phút, ở hầu hết các mẫu thử nghiệm quá trình oxy hóa beta-caroten chưa xảy ra hoàn toàn nên chưa thể đánh giá khả năng chống oxy hóa.
Kết quả được đánh giá sau 120 phút, quá trình oxy hóa xảy ra hoàn toàn ở các mẫu không có hoạt tính chống oxy hóa (gần như mất màu hoàn toàn beta-caroten).
Trong các dẫn chất nghiên cứu có 6 chất có hoạt tính chống oxy hóa là F5, F6, F7, F16, F30, F36; trong đó:
- Chất có hoạt tính cao nhất là F7 (68,0%), đối với BHT là 96,6 %, kế đến là F6 (53,2 %).
- Các chất có hoạt tính ở mức thấp là F5 (26,1 %), F16 (24,2 %) , F30 (22,0%), F36 (18,6%).
Chương 4 BÀN LUẬN
Trong 48 dẫn chất chrysin được tiến hành khảo sát tác dụng chống oxy hóa thông qua cơ chế bắt giữ gốc tự do DPPH, và cơ chế ức chế quá trình oxy hóa beta- caroten trong mô hình beta-caroten-acid linoleic, có 1 số kết quả như sau:
8 chất có khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH: F5 : 3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavon F6 : 3-hydroxy-3’,4’,5,7-tetramethoxyflavon F7 : 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon F9 : 3,3’,4’,7-tetraacethoxy-5-hydroxyflavon F16 : 3’,4’-dihydroxy-7-methoxyflavon F27 : 5,7-dihydroxy-6,8-dimethylsulfinylflavon F30 : 3-rutinose-3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavon F36 : 4’-allyl-5,7-dimethoxyflavon
Cụ thể khi so sánh với các chất khác không có tác dụng như sau:
F18 (5,7-dihydroxyflavon) không có tác dụng, trong khi đó F5 (3’,4’,5,7- tetrahydroxyflavon), F16 (3’,4’-dihydroxy-7-methoxyflavon) và F30 (3- rutinose-3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavon) có tác dụng tốt. Như vậy 2 nhóm –OH tại 2 vị trí 3’, 4’ giữ vai trò quan trọng trong việc bắt giữ gốc tự do.
F8 (3,3’,4’,5,7- pentamethoxyflavon) không có tác dụng, trong khi đó F6 (3- hydroxy-3’,4’,5,7-tetramethoxyflavon) có tác dụng tốt. Vậy nhóm –OH ở vị trí số 3 giữ vai trò quan trọng.
F7 (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon) có nhóm –OH tại cả 3 vị trí 3, 3’, 4’ có tác dụng tốt.
Như vậy những chất có khả năng bắt giữ gốc tự do cao trong công thức cấu tạo có nhóm hydroxyl (–OH) tại vị trí số 3 và/ hoặc có 2 nhóm –OH trên vòng B tại 2 vị trí kế nhau 3’, 4’ (F5, F6, F7, F16, F30).
2 chất F9, F36 không có cấu trúc này có hoạt tính thấp hơn 1 ít nhưng vẫn ở mức cao, trong đó:
F9 có các nhóm ceton ở cạnh nhau, và còn có 1 nhóm OH ở vị trí carbon số 5 cạnh nhóm ceton, tuy nhiên như đã chứng minh nhóm – OH ở vị trí số 5 không giữ vai trò quan trọng, vậy tác dụng là do các nhóm ceton cạnh nhau. F36 có nhóm thế không no allyl ở vị trí 4’có tác dụng, trong khi đó nếu ở vị
trí 4’ thay bằng các nhóm thế khác như –OCH3, –CH3, OBn, SCH3, Br (ở F10, F11, F12, F13, F35, F40) thì không có tác dụng này. Như vậy nhóm không no allyl ở vị trí 4’ giữ vai trò nhất định trong việc bắt giữ gốc tự do. F27 (có 2 nhóm thế methylsulfinyl tại vị trí 6, 8) vẫn có hoạt tính bắt giữ gốc tự do nhưng ở mức thấp, nếu thay bằng nhóm khác như Br (F1), I (F21) thì không còn tác dụng.
Trong 8 chất có khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH chỉ có 6 chất có khả năng ức chế quá trình oxy hóa beta-caroten trong mô hình beta-caroten-acid linoleic là F5, F6, F7, F16, F30, F36. Khả năng ức chế cao ở F6 (có nhóm –OH ở vị trí số 3), và cao nhất ở F7 (trong công thức có cả nhóm –OH ở vị trí số 3 và 2 nhóm –OH ở vị trí 3’, 4’). Các chất F5, F16, F30 không có nhóm –OH ở vị trí số 3 nhưng có cả 2 nhóm – OH ở vị trí 3’, 4’ và F36 có nhóm không no allyl ở vị trí 4’có khả năng ức chế quá trình oxy hóa nhưng ở mức thấp hơn nhiều. Như vậy nhóm –OH ở vị trí số 3 có vai trò quan trọng trong việc ức chế quá trình oxy hóa, và 2 nhóm –OH ở vị trí 3’, 4’ làm gia tăng tác dụng này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua thời gian thực hiện đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả sau:
Tổng hợp được 17 dẫn chất chrysin, bao gồm:
- 4 chất từ chrysin (ký hiệu từ F1 đến F4) - 5 chất từ rutin (ký hiệu từ F5 đến F9)
- 8 chất từ các dẫn chất của 2’-hydroxychalcon (ký hiệu từ F10 đến F17).
Trong quá trình tổng hợp sử dụng phương pháp halogen hóa bằng tác nhân oxon và muối halogen (NaX) thay cho phương pháp halogen hóa bằng nước brom giảm độc hại môi trường.
Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp
Xác định được tính chất vật lý như độ tan, nhiệt độ nóng chảy và đã tiến hành đo phổ UV, IR, 1H NMR của các chất trên.
Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của các dẫn chất chrysin
Ký hiệu Các dẫn chất chrysin F1 : 6,8-dibromo-5,7-dihydroxyflavon F2 : 7-ethoxy-5-hydroxylavon F3 : 5,7-diethoxyflavon F4 : 5,7-diacethoxyflavon F5 : 3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavon F6 : 3-hydroxy-3’,4’,5,7-tetramethoxyflavon F7 : 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon F8 : 3, 3’,4’,5,7-pentamethoxyflavon F9 : 3,3’,4’,7-tetraacethoxy-5-hydroxyflavon F10 : 4’,7-dimethoxyflavon F11 : 4’-benzyloxy-7-methoxyflavon F12 : 7-methoxy-4’-methylflavon F13 : 4’-bromo-7-methoxyflavon F14 : 3’,4’,5’,7-tetramethoxyflavon F15 : 3’,4’-dicloro-7-methoxyflavon F16 : 3’,4’-dihydroxy-7-methoxyflavon F17 : 3’-hydroxy-4’,7-dimethoxyflavon
Trong các chất khảo sát khả năng bắt giữ gốc tự do và tác dụng chống oxy hóa, có 8 chất có khả năng bắt giữ gốc tự do, trong đó có 6 chất có cả tác dụng chống oxy hóa beta-caroten. Từ đó thấy được sự liên quan giữa khả năng bắt giữ gốc tự do và hoạt tính chống oxy hóa.
Đánh giá sự liên quan giữa cấu trúc và tác dụng chống oxy hóa
Đã đánh giá và xác định được sự liên quan giữa cấu trúc và tác dụng chống oxy hóa, các nhóm chức giữ vai trò quan trọng trong chống oxy hóa và bắt giữ gốc tự do.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục tổng hợp thêm các dẫn chất 3’-hydroxyflavon bằng cách thay thế các nhóm thế ở vòng A, vòng B để khảo sát tác dụng chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác.
Nghiên cứu có chọn lọc tác dụng chống oxy hóa in vivo của các dẫn chất 3’- hydroxyflavon.
Nên sử dụng quercetin thay thế rutin vì ưu điểm vượt trội của nhóm 3’-hydroxy flavon trên tác dụng chống oxy hóa, tuy nhiên cần nghiên cứu thêm về tác dụng chống oxy hóa in vivo và quy trình sản xuất quercetin một cách kinh tế nhất.
So sánh động học hấp thu 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon (quercetin) và 3-hydroxy- 3’,4’,5,7-tetramethoxyflavon, theo dự đoán 3-hydroxy-3’,4’,5,7-tetramethoxyflavon sẽ hấp thu tốt hơn do ít phân cực hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn Hóa hữu cơ (2004), Các phương pháp quang phổ - tài liệu giảng dạy sau đại học, Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
2. Lê Thị Thiên Hương (2006), Độ ổn định của thuốc - tài liệu giảng dạy sau đại học, Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr. 30-56.
3. Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu tập I, Bộ môn dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 259-289.
4. Nguyễn Quang Thường (1998), Gốc tự do trong Y và Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội.
5. Nguyễn Quang Thường (1999), “Stress oxy hóa”, Tạp chí Dược học, Bộ y tế, (9), tr. 21- 22.
6. Lê Minh Uyên (2002), Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của một số chế phẩm từ trà actisô (Cynara scolymas) trên gan chuột nhắt, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
7. Trần Phi Hoàng Yến (2002), Nghiên cứu tính chất chống oxy hóa của viên nang Linh Chi (Ganoderma lucidum) trên chuột thực nghiệm, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. Ahmed M. Aboul-Enein, Farouk K. El Baz, Gamal S. El-Baroty, A.M. Youssef and Hanaa H. Abd El-Baky (2003), “Antioxidant activity
of Algal extracts on lipid peroxidation”, Journal of Medical Sciences, pp. 87-98.
9. Ayhan-Kilcigil G., Coban T., Tuncbilek M., Can-Eke B., Bozdag- Dundar O., Ertan R., Iscan M. (2004), “Antioxidant properties of flavone-6(4')-carboxaldehyde oxime ether derivatives”, Archives of Pharmacal Research, Pharmaceutical Society of Korea, South Korea, pp. 610-614.
10. Babu K. Suresh, Babu T. Hari, Srinivas P.V, Kishore K. Hara, Murthy U.S.N, Rao J. Madhusudana (2006), “Synthesis and biological evaluation of novel C (7) modified chrysin analogues as antibacterial agents”, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letter
(16), pp. 221-224.
11. Bernard Thomas Golding, Roger John Griffin, Charmaine Paulina Quarterman, John Alfred Slack, Jonathan Gareth Williams (2001), “Analogues or derivatives of quercetin (prodrugs)”, United states patent 6258840.
12. Choi Chun-Whan, Jung Hyun Ah, Kang Sam Sik, and Choi Jae Sue (2007), “Antioxidant constituents and a new triterpenoid glycoside from Flos Lonicerae”, Arch Pharm Res, Korea, pp. 1-7.
13. Critchfield JW., Butera ST., Folks TM. (1996), “Inhibition of HIV activation in latenly infected cells by flavonoid compounds”, AIDs Res Hum Retroviruses, pp. 39-46.
14. Esterbawer H., Gebicki J., et al (1994), “The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL”, Free radical Biology and Medicine (13), pp. 314-390.
15. Fariba Shrififar, Nargess Yassa, Abbas Shafiee (2003), “Antioxidant activity of Otostegia persica (Labiatae) and its constituents”,
Iranian Journal of Pharmaceutical Research, pp. 235-239. 16. Haliwell B. (1994), “Free radical and antioxidant”, Nution reviews.
17. HaliwellB., Chirico S. (1993), “Lipid peroxidation: its mechanism, measurement and significance”, American J. of Clinical nutrition
(57), pp. 715-725.
18. Herwig Buchholz, Ralf Rosskopf, Alice Lichtenberg, Christine Kraus
(2003), “Method for producing luteolin and luteolin derivatives”,
United states patent 6538021.
19. Hiroya Takada, Ken Kokubo, Kenji Matsubayashi and Takumi Oshima (2006), “Antioxidant activity of supramolecular water-soluble fullerenes evaluated by beta-carotene bleaching assay”, Biosci Biotechnol Biochem, Japan, pp. 3088-3093.
20. Jeong HJ, Shin YG, Kim IH, Pezzuto JM (1999), “Inhibition of aromatase activity by flavonoids”, Arch Pharma Res, pp.309-312. 21. Jung SJ, Kim DH, Hong YH, Lee JH, Song HN, Rho YD, Baek NI
(2007), “Flavonoids from the flower of Rhododendron yedoense var. Poukhanense and their antioxidant activities”, Arch Pharm Res, pp. 146-150.
22. Kadifkova Panovska T, Kulevanova S, Stefova M (2005), “In vitro antioxidant activity of some Teucrium species (Lamiaceae)”, Acta Pharm, pp. 207-214.
23. Kellis, J.T., Jr., Nesnow, S. and Vickery (1986), “Inhibition of aromatase