Trên hình III.11 là đường CV của chip sợi nano vàng với các nồng độ cholesterol khác nhau. Trên các đường CV này chúng tôi thu nhận được một peak oxi hóa ở vị trí E=0.9V, hơn thế nữa giá trị của peak oxi hóa này còn tẳng khi tăng nồng độ cholesterol, từ đó chúng tôi có thể đưa ra kết luận rằng đây chính là peak đặc trưng cho hàm lượng cholesterol trong dung dịch và điện cực sợi nano vàng với quy trình hoạt hóa bề mặt bằng cysteamine có thể được sử dụng để xác định cholesterol. Dựa vào peak oxi hóa thu được từ đường CV trong hình III.11.A chúng tôi đã xây dựng một đường đặc trưng của nồng độ cholesterol theo cường độ peak thu được và kết quả được thể hiện trên hình III.11.B. Từ đường đặc trưng này chúng tôi có thể kết luận là nồng độ cholesterol phu thuộc vào cường độ của peak thu được một cách tương đối tuyến tính trong khoảng nồng độ thực nghiệm từ 1 đến 7 mM với độ nhạy 8.7 nA/mM và chip sợi nano vàng được gắn enzyme bằng phương pháp hoạt hóa bề mặt bởi cysteamine có thể được ứng dụng làm cảm biến cholesterol cho các nghiên cứu về sau.
(A) (B)
Hình III.11. đường CV của chip sợi nano vàng được hoạt hóa bởi cysteamine trong dung dịch cholesterol/PBS + 5%triton X-100 pH=7 ở các nồng độ cholesterol khác nhau từ 1 đến 7 mM (A) và đường chuẩn nồng độ - cường độ peak thu được từ đường CV (B) y = 0.0087x + 0.0711 R² = 0.9869 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0 2 4 6 8 I(µA) C(mM)
Để xác định hoạt tính của enzyme trên điện cực, chúng tôi tính toán hằng số Michaelis-Menten 𝐾𝑚𝑎𝑝𝑝. Hằng số này được tính dựa trên đường Lineweaver – Burke (hìnhV.12.A), là đường tương quan giữa nghich đảo nồng độ chất phản ứng và nghịch đảo cường độ peak, và đường Hanes (hìnhV.12.B) là đường tương quan giữa nồng độ chất phản ứng và tỷ lện nồng độ chất phản ứng/cường độ dòng peak. Các phương pháp tính toán này dựa trên việc biến đổi phương trình Michaelis – Menten:
Đối với trường hợp đường Lineweaver – Burke ta có:
Trong đó V là tốc độ phản ứng và Vmax là tốc độ phản ứng tối đa, [S] là nồng độ chất phản ứng và Km là hằng số Michealis – Menten.
Trong trường hợp đường Hanes ta có:
Giá trị của hằng số 𝐾𝑚𝑎𝑝𝑝 phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như loại ma trận và phương pháp cố định enzyme do các yếu tố này ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme và cơ chế hoạt động của enzyme rất nhạy với môi trường. Do đó giá trị của hằng số
𝐾𝑚𝑎𝑝𝑝 bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố này. Hằng số 𝐾𝑚𝑎𝑝𝑝 đặc trưng cho ái lực của enzyme đối với cơ chất của nó, giá trị 𝐾𝑚𝑎𝑝𝑝 càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn.
(A) (B)
Hình III.12. Đường Lineweaver – Burke (A) và đường Hanes (B) của chip sợi nano vàng được hoạt hóa bởi cysteamine
Giá trị hằng số 𝐾𝑚𝑎𝑝𝑝 tính đoán được từ đường Lineweaver trong hình III.12.A là 4.8 mM (ở khoảng nồng độ cholesterol cao). Việc tồn tại 2 khoảng tuyến tính trên
y = 22.298x + 4.6132 R² = 0.9932 y = 1.4059x + 11.534 R² = 0.9818 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 0 0.5 1 1.5 1/ I ( µA -1) 1/C (mM-1) y = 6.5388x + 11.586 R² = 0.9387 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 0 2 4 6 8 C/I (m M /µ A) C (mM)
đường Lineweaver – Burke cho thấy giá trị 𝐾𝑚𝑎𝑝𝑝 thực tế khác với giá trị thu được từ khoảng nồng độ cholesterol cao. Để đưa ra một giá trị chính xác cho toàn bộ khoảng nồng độ của cholesterol, chúng tôi sử dụng đường Hanes mà trong đó tất cả các điểm số liệu đều nằm trên một đường thẳng (hình III.12.B) và giá trị 𝐾𝑚𝑎𝑝𝑝 thu được là 1.77 mM. Giá trị 1.77 mM cho thấy ái lực cao của điện cực Au được hoạt hóa bởi cysteamine đối với cholesterol và cũng cho thấy sự tương thích cao của cholesterol oxidase đối với điện cực nano Au được hoạt hóa bởi cysteamine.
Độ lặp lại của điện cực được khảo sát bằng thực nghiệm đo quét thế vòng tuần hoàn (CV) đối với 5 điện cực và mỗi điện cực được đo 5 lần khác nhau với nồng độ cholesterol 3 mM. Kết quả được thể hiện trên hình III.13.A cho thấy sự khác biệt về dòng điện trong cùng một điện cực là khoảng 2.5% và giữa các điện cực với nhau là 6%.
(A) (B)
Hình III.13: độ lặp lại của điện cực (A) và độ ổn định (B) với dung dịch cholesterol 3mM
Độ ổn định của điện cực được xác định bằng thực nghiệm CV với chu kỳ là 2 ngày trong vòng 20 ngày với nồng độ cholesterol là 3mM. Độ ổn định của điện cực theo cường độ peak được trình bày trên hình III.13.B cho thấy điện cực vàng được hoạt hóa bởi cysteamine giữ được khoảng 78% hoạt tính sau 20 ngày bảo quản. Sự sụt giảm nhanh chóng về hoạt tính của điện cực có thể do sự mất hoạt tính cũng như mất mát của enzyme trong quá tronhf bảo quản.