Việc cố định các thành tố sinh học, nhất là enzym thường đem lại nhiều tác dụng hơn trong phản ứng như:
Làm cho enzym trong nhiều trường hợp bền hơn.
Tách phức enzym – chất mang ra khỏi mẫu dễdàng.
Hoạt độ enzym giữ được ổn định trong một thời gian dài.
Tuy nhiên, việc sử dụng enzym cố định cũng có những hạn chế nhất định như:
Sự chuyển khối bị hạn chế.
Có thể mất hoạt tính khi cố định.
Không có hiệu quả đối với cơ chất rắn.
Mất tính thích nghi hình thể.
Nhưng những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại, do vậy ngày càng có nhiều nghiên cứu mới cũng như các công nghệ mới để cố định enzym.
Người ta thường cố định các thành phần sinh học lên một chất mang rắn bằng nhiều cách. Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo những yêu cầu nhất định, nhất là khi các cảm biến sinh học (biosensor) được đưa vào sử dụng trong thực tế:
Các cấu tử sinh học phải giữ được hoạt độ khi gắn trên bề mặt cảm biến sinh học.
Màng sinh học phải được gắn chặt với bề mặt cảm biến và vẫn giữ được cấu trúc và chức năng.
Màng sinh học đã được cố định phải ổn định và bền trong một thời gian dài.
Để cố định các thành phần sinh học trong Cảm biến sinh học, người ta thường sử dụng các kỹ thuật như hấp thụ vật lý, bao gói trong khuôn gel hoặc trong polymer, liên kết đồng hóa trị với chất mang và liên kết chéo các protein.[19-20]
1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme 1.3.2.1 Phương pháp vật lý 1.3.2.1 Phương pháp vật lý
Nguyên tắc của phương pháp hấp phụ vật lý như sau:
Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein như lực Van der Waals, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Khi chất mang không có lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang. Khi chất mang có lỗ xốp, enzym chui vào trong các lỗ xốp của chất mang.
Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết giữa chất mang và enzym là liên kết ion (Liên kết này bền hơn so với hấp phụ).
Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ hay liên kết ion:
Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin.
Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide kim loại.
Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE – celllulose, CM – cellulose.
Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl. Phương pháp điều chế: Cho enzym và chất mang tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại bỏ những phân tử bị gắn yếu lên chất mang.
Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bền của liên kết cố định
Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuận với nồng độ của nó ởmột giới hạn nhất định.
pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện ở chất mang cũng như ởprotein enzym. Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzym cố định được bằng liên kết ion. Đồng thời sựthay đổi pH đột ngột thường dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzym.
Lực ion của môi trường: sự có mặt của các muối tích điện trái dấu với chất mang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong dung dịch. Tuy nhiên, sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của protein do đó ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định.
Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm tăng liên kết protein enzym với chất mang, nhưng cũng làm mất hoạt tính của enzym.
Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzym có khối lượng phân tử càng nhỏ thì hấp phụ càng cao. Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt hơn và bền hơn.
Tuy nhiên sự cố định vật lý ngày nay ít được sử dụng do sự có mặt của enzym trong dung dịch không giữ được hoạt tính trong thời gian dài. Do đó sự cố định hóa học, sử dụng các liên kết đồng hóa trị sẽ đảm bảo độ bền của enzym trong một thời gian khá dài.[21-24]
1.3.2.2 Phương pháp liên kết ngang (crosslinking)
Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nối giữa các nhóm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợp chất có trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và không có tính hòa tan.
Có thể tạo liên kết ngang các phân tử của cùng enzym hay cố kết hai hay nhiều protein với nhau (enzym với enzym hay enzym với protein hoặc nhiều enzym trên protein mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bò (BSA). Ngay cả cơ quan hay các tế bào cũng có thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang. Glutaraldehyde là một trong những tác nhân tạo liên kết ngang thường được sử dụng trong việc cố định enzyme. Tác nhân này có hai nhóm chức aldehyde ở các đầu mạch, các nhóm chức này sẽ phản ứng với nhóm amine trên phân tử protein hay enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base:
Cũng có thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác như hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang.
Có 3 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang:
Phương pháp ngâm: điện cực sau khi được làm sạch bề mặt được ngâm vào trong dung dịch tác nhân tạo liên kết và enzyme để cố định enzyme lên bề mặt điện cực. Ưu điểm của phương pháp này là phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các enzyme lên đa số các bề mặt điện cực, đặc biệt là các bề mặt nhỏ.
Phương pháp kết hợp trực tiếp: dung dịch enzyme và tác nhân liên kết được nhỏ trực tiếp lên bề mặt điện cực. Ưu điểm của phương pháp này là tiết kiệm
enzyme, nó thường được sử dụng để cố định các loại enzyme có giá thành cao, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là chỉ thích hợp đối với các điện cực có bề mặt lớn.
Phương pháp sử dụng bình phun: điện cực được ngâm trong enzyme sau đó được làm khô và glutaraldehyde được phun lên bề mặt điện cực dưới dạng hơi sương ở một khoảng cách đủ lớn để tránh tạo giọt, sau khi tạo liên kết ngang điện cực được rửa lại với nước. Ưu điểm của phương pháp này là lớp enzyme mỏng làm cho cảm biến có thời gian đáp ứng ngắn.[25]
1.3.3 Phương pháp đơn lớp tự lắp ghép (self assembly monolayer – SAM) 1.3.3.1 Khái niệm về phương pháp đơn lớp tự lắp ghép 1.3.3.1 Khái niệm về phương pháp đơn lớp tự lắp ghép
SAM là một đơn lớp có độ dày cỡ phân tử được hình thành do sự tự sắp xếp của các phân tử theo một trật tự dựa trên sự hấp thụ hóa học của các phân tử đó hướng đến một trạng thái năng lượng ổn định trên một bề mặt rắn. SAM là dạng cơ bản nhất của một màng mỏng hữu cơ ở kích thước nano, chúng ổn định hơn màng mỏng được tạo bằng phương pháp Langmuir – Blodgett do các phân tử được hấp thụ lên bề mặt rắn thông qua liên kết hóa học. Sự hấp thụ hóa học của một phân tử lên trên một bề mặt sẽ khóa lại một nhóm chức của phân tử đó (nhóm chức để liên kết với bề mặt rắn) và nhóm chức còn lại tự do với khả năng sử dụng cho nhiều ứng dụng khác nhau. SAM có thể được tạo thành từ các phân tử có kích thước lớn hoặc nhỏ khác nhau. Để tạo thành đơn lớp không có sai hỏng, thích hợp cho việc gắn kết các phân tử sinh học thì người ta ưu tiên sử dụng SAM được tạo thành từ các phân tử có mạch alkane dài với bề mặt được sắp xếp và đóng gói tốt hơn. SAM của các phân tử có kích thước nhỏ thích hợp hơn trong trường hợp cần có các sai hỏng để tạo thành các kênh chuyển điên tích cho dòng điện tích tạo thành từ phản ứng có thể di chuyển đến bề mặt của điện cực.
Sự hình thành của các phân tử tự lắp ghép một cách có trật tự cung cấp một môi trường rộng lớn cho các ứng dụng bề mặt ở cấp độ phân tử. SAM cung cấp một hệ thống thuận tiện, linh hoạt và đơn giản cho sự hình thành của đơn lớp được sắp xếp với khả năng thay đổi tính chất bề mặt của kim loại, oxide kim loại và bán dẫn ở cấp độ phân tử. Chúng có thể giúp loại bỏ vấn đề về tương thích bề mặt, làm tăng tính ổn định nhiệt của thiết bị và có thể được sử dụng để nâng cao hiệu ứng lượng tử ngoài của diode phát quang hữu cơ. Chúng cũng có tác dụng như là một bề mặt mới để nghiên cứu các quá trình sinh học và sinh hóa. Hai loại SAM phổ biến nhất được nghiên cứu và ứng dụng hiện nay là SAM của các hợp chất sulfur hữu cơ trên bề mặt vàng và của các hợp chất silane trên bề mặt bán dẫn và oxide kim loại.[26-28]
1.3.3.2 Sự hình thành SAM
Bề mặt kim loại hay oxide kim loại sạch có khuynh hướng hấp thụ các chất hữu cơ để tạo thành SAM do việc hấp thụ này làm giảm năng lượng tự do của bề mặt tương tác giữa kim loại/oxide kim loại với môi trường xung quanh. Sự hình thành SAM từ dung dịch loãng cho một đơn lớp được sắp xếp có trật tự trong khi ở nồng độ cao và thời gian dài thì có thể tạo thành màng đa lớp. Chất hấp thụ có thể bao phủ hoàn toàn bề mặt trong một thời gian ngắn (vài millisecond đến vài phút) đối với dung dịch có nồng độ millimolar, tuy nhiên để tạo thành một đơn lớp có độ xếp chặt các phân tử là tối đa và giảm các sai hỏng thì cần đến hàng giờ cho quá trình sắp xếp lại. Bieri và cộng sự đã chứng minh là sự tạo thành SAM của rất nhiều hợp chất sulfur hữu cơ là vô cùng phức tạp, nó khác xa so với trường hợp hấp thụ Langmuir đơn giản và bao gồm 2 bước chính là sự sắp xếp lại của các phân tử theo sau bởi quá trình khử proton. Việc sử dụng 2 hợp chất silane hay sulfur hữu cơ với một tỷ lệ mole đặc biệt có thể tạo thành một đơn lớp hỗn hợp. Người ta đã chứng minh rằng đơn lớp hỗn hợp có thể được sử dụng để cố định các phân tử sinh học mà không gặp phải trở ngại về cản trở không gian.
Sự hình thành SAM của sulfur hữu cơ trên bề mặt vàng: SAM của sulfur hữu cơ là hệ thống đơn lớp được nghiên cứu nhiều nhất cho đến nay với những tính chất ưu việt nhất như các phân tử được sắp xếp có trật tự cao, cấu trúc của nhóm bề mặt linh hoạt và phương pháp chuẩn bị và phân tích đơn giản. SAM của các sulfur hữu cơ thường được sử dụng đối với bề mặt kim lọại như vàng, platin, bạc, đồng, palladium… và sự sắp xếp của các phân tử SAM trên bề mặt phụ thuộc chủ yếu vào độ dài của chuỗi alkan của chúng. Khả năng tương thích cao của sulfur hữu cơ đối với các kim loại như vàng chủ yếu dựa vào tương tác acid – base yếu theo lý thuyết về acid base mạnh và yếu. Những đơn lớp này chủ yếu hình thành từ các hợp chất thiol, dialkyl disulfide và sulfide trong các dung môi có độ tinh khiết cao như ethanol, acetone, hexane, nước…
Hình I.6: sự hình thành SAM từ sulfur hữu cơ
Alkane thiol dùng trong tự lắp ghép có cấu tạo gồm 3 thành phần chính: nhóm hoạt động bề mặt (sulfur) liên kết mạnh với bề mặt kim loại (vàng, platin, bạc), chuỗi alkyl tạo sự ổn định cho đơn lớp bằng tương tác Van der Waals, và một nhóm chức năng ω đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết các phân tử sinh học với đơn lớp. Thông qua việc lựa chọn nhóm chức năng, tương tác đặc trưng giữa bề mặt và dung dịch (hóa trị, tĩnh điện hay kỵ nước)có thể được sử dụng để liên kết các phân tử tới bề mặt tương tác. Cơ chế của quá trình hấp thụ các hợp chất sulfur hữu cơ lên platin (Pt), bạc (Ag) và vàng (Au) sử dụng phản ứng điện hóa cho thấy không có phản ứng điện hóa xuất hiện trong quá rình hấp thụ hóa học trên bề mặt Pt trong khi trên bề mặt Au và Ag thì có phản ứng anode với các hợp chất thiol và phản ứng cathode với các hợp chất dialkyl disulfide. Quá trình hấp thụ hóa học bị ảnh hưởng lớn bởi các chất oxi hóa khử, pH của dung dịch, oxi hòa tan, điện thế của kim loại đối với dung dịch có chứa chất hấp thụ.[29-30]
1.3.3.3 Các phương pháp phân tích SAM
Việc phân tích một đơn lớp có thể được thực hiện bởi nhiều phương pháp khác nhau như phép đo góc tiếp xúc, các phép đo điện hóa như quét thế vòng tuần hoàn hay phổ tổng trở điện hóa. Một đơn lớp cũng có thể được phân tích bởi phương pháp phổ hồng ngoại, phổ X-ray photoelectron, ellipsometry, cộng hưởng Plasmon bề mặt, kính hiển vi quét mục tiêu như kính hiển vi điện tử quét hay kính hiển vi quét xuyên ngầm, kính hiển vi lực nguyên tử…
Phương pháp đo góc tiếp xúc: chất lượng và độ đồng đều của một đơn lớp với độ dài khác nhau có thể được xác định bằng phép đo góc thấm ướt. Nhóm bề mặt ngoài trên chuỗi hydrocarbon của đơn lớp SAM quyết định tính ưa nước hay kỵ nước của
đơn lớp đó và do đó phương pháp đo góc thấm ướt hay góc tiếp xúc (CA) có thể được sử dụng để xác định sự hình thành của đơn lớp SAM.
Phương pháp đo phổ hồng ngoại (FT-IR): phương pháp phổ là một phương pháp hữu hiệu để xác định định hướng và sự sắp xếp của phân tử trong đơn lớp SAM.
Kính hiển vi quét mục tiêu: chất lượng và độ đồng đều bề mặt của một đơn lớp với độ dài khác nhau (từ micro đến nano) có thể được xác định trực tiếp bằng hình ảnh độ gồ ghề bề mặt bởi kính hiển vi lực nguyên tử (AFM), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi quét xuyên ngầm (STM).
Phương pháp điện hóa:trong các phương pháp điện hóa thì phổ tổng trở (EIS) và quét thế vòng tuần hoàn (CV) là hai phương pháp hữu hiệu nhất để nghiên cứu quá trình chuyển điện tích và phát hiện các sai hỏng và lỗ trong đơn lớp SAM. Phương pháp CV có thể dùng để xác định các trạng thái oxi hóa khử, cấu tạo bề mặt, các vùng sai hỏng và độ bao phủ. Phổ tổng trở có thể cung cấp thông tin về cơ chế của quá trình chuyển điện tử bằng cách đo điện dung lớp kép và điện trở của đơn lớp. [31]
1.4 Kỹ thuật quét thế vòng tuần hoàn
Phương pháp quét thế vòng tuần hoàn (CV – cyclic voltammetry) thuộc loại phương pháp đo điện hóa, nó được sử dụng để nghiên cứu các phản ứng oxi hóa khử khống chế bởi quá trình khuếch tán.
Đây là phương pháp thực nghiệm điện hóa điều khiển bằng thế. Áp điện thế biến thiên theo thời gian lên một điện cực và quan sát đáp ứng điện tương ứng, phân tích đáp ứng điện này sẽ thu được thông tin nhiệt động học và động lực học của sự truyền điện tích giữa điện cực và dung dịch, cũng như động lực học và cơ chế của phản ứng hóa học gây ra do sự chuyển điện tích này.
1.4.1 Nguyên lý
Một nguồn phân thế (potentiostat) làm nhiệm vụ điều khiển các thông số thực nghiệm. Mục đích của nó là quét một điện thế tuần hoàn tuyến tính biến thiên theo thời gian (hình I.7) trên một điện cực (gọi là điện cực làm việc) và xuất ra kết quả là một đường cong dòng-thế.
Quá trình quét thế được thực hiện từ thế đầu tiên (Eđ) đến thế cuối (Ec) và ngược lại với vận tốc quét là v [V/s]. Nếu quét thế từ phía dương đến phía âm thì
E = Eđ + vt (thế thuận) E = Es – vt (thế nghịch)
Từ hình dạng của đồ thị quét thế vòng có thể xác định được phản ứng xảy ra trên điện cực là thuận nghịch, bất thuận nghịch hay giả thuận nghịch; điện thế tại đó xảy ra các phản ứng oxi hóa, khử; điện dung của tế bào điện hóa; số điện tử trao đổi cho quá