Sau khi gắn enzyme thành công ở bước trên, các chip sợi nano vàng được sử dụng để xác định nồng độ cholesterol trong dung dịch. Nguyên lý của cảm biến này dựa trên sự xác định nồng độ H2O2 được giải phóng từ phản ứng oxi hóa cholesterol bởi enzyme cholesterol oxidase bằng phương pháp điện hóa. Thực nghiệm xác định cholesterol ở các nồng độ khác nhau được thực hiện sau khi ngâm chip trong dung dịch cholesterol trong thời gian 1 phút để enzyme có thể oxi hóa hoàn toàn cholesterol trong dung dịch tạo ra H2O2. Tiếp theo đó, H2O2được oxi hóa bằng phương pháp quét thế vòng tuần hoàn ở khoảng thế quét từ 0.25 đến 1V với tốc độ quét thế là 100 mV.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá kết quả chế tạo sợi nano vàng bằng ký thuật DEA 3.1.1 Kết quả chế tạo sợi nano vàng
Hình III.1. Hình SEM độ phân giải thấp của chíp silicon có sợi nano vàng, các đơn sợi được chế tạo cùng với điện cực nối riêng biệt nối ra mạch điều khiển ngoài (mạch
điện tử, hệ đo).
Hình III.3: Chip sợi nano vàng dùng cho định lượng cholesterol. Bên trái là hình các chíp chứa trong hộp chuyên dụng. Bên phải là hình SEM độ phân giải cao của phần
trên chíp chứa các sợi nano Au. Hình bên dưới là hình SEM của bốn sợi nano Au, chụp trên thiết bị của Viện Công Nghệ Nano MESA+, Hà lan.
Hình III.1 là hình tổng thể của chíp silicon có các sợi nano vàng đề tài đã chế tạo ra cho mục đích khảo sát tính chất điện của sợi nano. Kích thước của chip là 7x7 mm. Các chip đều được chế tạo với điện cực có kích thước lớn, thích hợp cho việc kết nối tích với hợp mạch điều khiển bên ngoài (kết nối Nano-Micro-Macro). Chúng ta có thể thấy trong hình này là các chip có đơn sợi nano với độ dài khác nhau từ 5 đến 500 µm và có 4 điện cực để nối ra mạch ngoài nhằm mục đích xác định ảnh hưởng của độ dài tới điện trở của sợi cũng như điện trở tiếp xúc giữa sợi nano và điện cực micro. Hình III.2 là hình ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) của đơn sợi cùng các điện cực riêng biệt của mỗi sợi.
Sợi 100 nm Sợi 100 nm
Hình III.3 là một số chip sợi nano vàng trên đế silic dùng cho ứng dụng định lượng cholesterol bằng phương pháp đo điện hóa. Kích thước của chip này là 3x25 mm bao gồm 100 sợi nano có chiều dài sợi là 200 µm với 1 điện cực macro để nối ra mạch ngoài.
3.1.2 Kết quả đo điện trở sợi nano vàng
Trong báo cáo này, các sợi nano Au được áp các thế một chiều (DC) sao cho các dòng điện trong khoảng khảo sát cỡ µA. Đây là khoảng giá trị dòng điện thích hợp mà các cảm biến cholesterol sẽ làm việc sau này.
(A): Sợi dài 5 µm.
(B): Sợi dài 20 µm. -2500 -2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000 2500 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 mV uA Series1 Series2 Series3 -800 -600 -400 -200 0 200 400 600 800 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 mV uA Series1 Series2 Series3
C: Sợi dài 50 µm
D: Sợi dài 500 µm
Hình III.4. Đặc trưng tính chất điện I-V của sợi nano Au có chiều rộng 50 nm, độ dày 25 nm, và chiều dài thay đổi từ 5 đến 500 µm. Điện thế một chiều được quét trong giá trị từ -1 volt đến + 1 volt, với bước quét 50 mV.
Hình III.4 là các đặc trưng điện của sợi nano Au với các kích thước chiều ngang và độ dày khác nhau. Để đạt được kết quả đo này, 20 linh kiện được sử dụng cho mỗi loại mẫu, và với mỗi loại mẫu được đo lặp lại 10 lần ở cùng một chế độ đo, cho phép khảo sát kết quả trung bình cũng như độ lặp lại chứng tỏ tính thống kê của kết quả đo. Kết quả này cho phép xác định điện trở của sợi, và quan trọng nhất là xác định được chế độ làm việc của sợi sau này để có dòng điện thích hợp trong khoảng µA cho cảm biến. -300 -200 -100 0 100 200 300 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 mV uA Series1 Series2 Series3 -30 -20 -10 0 10 20 30 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 mV uA Series1 Series2 Series3
Ngoài ra do điện trở tiếp R tiếp xúc ~ 1/A lên khi kích thước sợi ở kích thước nano, do diện tích tiếp xúc giữa sợi và điện cực là rất nhỏ, khi đó điện trở tiếp xúc giữa sợi và điện cực trở lên một thông số có ảnh hưởng nhiều đến điện trở đo đạc, và cần phải khảo sát (1-10, 33). Do đó nhóm tác giả đã thiết kế cấu trúc đo 4 điện cực ( Hình IV.33), cho phép xác định điện trở tiếp xúc của sợi nano và kết quả được trình bày trong bảng III.1. Điện trở tiếp xúc cỡ 20±5 ôm là chấp nhận được cho đặc tính cảm biến sau này.
Kết quả tuyến tính của đường I-V và điện trở của sợi tính toán từ phép đo cho thấy sợi chế tạo mang đúng đặc trưng của kim loại Au. Tuy thế điện trở đo đạc được có giá trị cao hơn giá trị tính toán lý thuyết (dựa vào giá trị của vật liệu khối theo phương trình s
l R= ρ
) là 30-40%. Kết quả này có thể do những yếu tố như sự thay đổi điện trở suất khi kim loại được chế tạo ở kích thước siêu nhỏ nano; ảnh hưởng của quá trình chế tạo gây tạp bẩn làm tăng điện trở của sợi… Tuy thế đây là hiện tượng đã được công bố về điện trở của dây dẫn nano. Ví dụ như nhóm nghiên cứu của Penner tại đại học California chế tạo sợi nano kim loại và đo đạc được kết quả tăng từ 50- 250% cho điện trở của sợi nano kim loại Pt, Au, Pd.
Hình III.5: Cấu trúc 4 điện cực dùng xác định điện trở tiếp xúc của sợi nano.
Bảng III.1 đưa ra các kết quả đo đạc I-V trung bình cho các sợi nano Au chế tạo ra với các kích thước khác nhau, độ dày khác nhau. Kết quả tính toán lí thuyết cũng được đưa ra để so sánh.
TT L (µm) R tổng Rt(ohm) R contact Rct(ohm) R sợi Rs(ohm) R lí thuyết Rlt(ohm) Rs/Rlt (%) Rs/Rlt của nhóm n/c khác (%) 1 5 444.2 20±5 408.0 294.4 138.5 1501 5 453.3 5 446.6 2 20 1581.7 1542.2 1177.6 130.9 20 1571.2 250-3002 20 1593.7 3 50 4098.2 3988.6 2944.4 135.4 50 3994.3 50 3933.3 200-2503 4 500 43154 41668.0 29444.0 141.5 500 40374 500 41596
Bảng III.1: Kết quả đo điện trở từ khảo sát đặc trưng I-V của các sợi nano Au chế
tạo. Điện thế quét 1 Volt, với bước quét 50 mV, chiều dài sợi thay đổi từ 5-1000 µm. Chiều ngang sợi la 50 nm, chiều dày 25 nm.
Từ các kết quả đo đạc cho thấy các sợi nano vàng có kích thước quá nhỏ và quá mỏng sẽ có điện trở thay đổi nhiều so với thông số dự đoán. Điều này có thề giải thích qua việc với kích thước quá nhỏ, điện trở sợi trở lên quá nhạy cảm với các thay đổi trong quá trình chế tạo, dẫn đến tính không ổn định của cảm biến sau này. Ngược lại, khi sợi có kích thước lớn hơn, điện trở ổn định hơn, tuy thế lại hạn chế đến độ nhạy của cảm biến sau này. Với chip sợi nano vàng dùng trong định lượng cholesterol, số lượng sợi trên mỗi chip sẽ là 100 sợi và được kết nối với nhau theo kiểu song song, do đó điện trở của hệ sợi sẽ nhỏ hơn điện trở của đơn sợi 100 lần và cường độ dòng điện qua hệ sợi sẽ lớn hơn cường độ dòng điện qua đơn sợi 100 lần. Chính vì các lí do trên sợi nano Au có độ dày 25 nm, có chiều ngang 40-50 nm, chiều dài trong khoảng 50-
500 micro sẽ được tiếp tục khảo sát trong môi trường điện hóa để đưa ra kích thước tối ưu của sợi nano vàng dùng cho định lượng cholesterol.
3.1.3 Kết quả chụp kính hiển vi điện lực nguyên tử (AFM)
Trong khi các quan sát bằng ảnh SEM cho phép quan sát bề mặt phẳng của sợi, các quan sát bằng kính hiển vi lực nguyên tử lại cho phép khảo sát bề mặt 3 chiều của sợi nano Au, cung cấp thêm các thông tin hữu ích khác về hình dạng và tính chất hạt của sợi. Hình III.6 là hình ảnh AFM của sợi nano chế tạo ra trong luận văn này.
(a) (b)
Hình III.6. Hình ảnh AFM 2 chiều (A) và 3 chiều (B) của sợi nano Au
Hình trên cung cấp thêm các thông tin về kích thước, định dạng và cấu tạo bề mặt sợi. Sợi có chiều ngang 50 nm, chiều cao khoảng 50 nm và bề mặt mịn.
3.2 Kết quả kiểm tra tính chất của chip sợi nano vàng trong quá trình hoạt hóa bề mặt bề mặt
Hình III.7. Đường quét CV của chip sợi nano vàng trong dung dịch H2SO4 10 mM
Trên hình III.7 là đương quét trong dung dịch H2SO4 10 mM của chip sợi nano vàng trong quá trình làm sạch. Chúng ta có thể thấy rằng sau một số lần quét thì đường CV bắt đầu ổn định và cho một peak khử rõ rang tại E = 0.8V là peak khử của vàng, qua đó có thể kết luận bề mặt chip vàng đã được khử về trạng thái Au0tinh sạch cho các bước hoạt hóa bề mặt tiếp theo.
Hình III.8. Đường CV của chip sợi nano vàng trong dung dịch K3Fe(CN)6 5mM trong PBS pH 4 trước và sau khi được hoạt hóa bởi cysteamine
Hình III.8 là đường quét CV của chip sợi nano vàng trước và sau khi được hoạt hóa bởi cysteamine. Sau khi được hoạt hóa bởi cysteamine, trên đường CV của chip vàng có xuất hiện peak oxi hóa khử của K3Fe(CN)6 một cách rõ ràng. Nguyên nhân của việc xuất hiên peak này là do bề mặt chip sợi nano vàng được bao phủ bởi lớp cysteamine với các nhóm NH2 ở đầu mạch. Các nhóm NH2 (amine) này trong môi trường acid (pH=4) sẽ kết hợp với ion H+trong dung dịch để hình thành ion 𝑁𝐻3+ trên
bề mặt điện cực làm cho bề mặt điện cực tích điện dương trong khi đó K3Fe(CN)6 trong dung dịch bị phân ly thành ion K+ và Fe(CN)63-. Bề mặt điện cực tích điện dương sẽ hút các ion Fe(CN)63- bởi lực hút tĩnh điện làm tăng nồng độ bề mặt của Fe(CN)63-từ đó làm tăng giá trị peak oxi hóa khử thu được.
Hình III.9. đồ thị sự phụ thuộc của cường độ peak oxi hóa khử theo thời gian của chip Au/CA với các nồng độ cysteamine khác nhau khi quét trong dung dịch
K3Fe(CN)6 trong PBS pH 4
Trong hình III.9 là sự phụ thuộc của cường độ peak oxi hóa khử theo thời gian của chip đã được hoạt hóa bề mặt bởi cysteamine với các nồng độ cysteamine khác nhau khi quét trong dung dịch K3Fe(CN)6 trong PBS pH 4. Ở nồng độ cysteamine (CA) 100 mM, sau 20 giờ phản ứng thì peak oxi hóa vẫn tiếp tục tăng, điều này có thể dự đoán là do đơn lớp vẫn chưa được hình thành hoàn toàn trên bề mặt sợi vàng. Với nồng độ CA 200 mM, peak oxi hóa đạt giá trị cực đại sau 8h và không thay đổi sau 20 giờ ngâm, qua đó có thể dự đoán là đơn lớp đã được hình thành bao phủ hoàn toàn bề mặt sợi nano vàng và vẫn chưa hình thành màng đa lớp. Đối với nồng độ CA 300 mM, peak oxi hóa cũng đạt cực đại sau 8h ngâm chip nhưng giảm mạnh sau 20 giờ, nguyên nhân của sự giảm này được dự đoán là do sự hình thành của màng đa lớp dẫn tới tăng điện trở của điện cực vàng làm giảm cường độ peak. Đối với nồng độ CA 400 mM, peak oxi hóa tăng nhẹ sau 4h ngâm và gần như giữ nguyên giá trị sau 20 giờ, điều này được dự đoán là do đã hình thành màng đa lớp rất sớm do đó làm cho giá trị của peak oxi hóa không thể tăng. Qua đường ảnh hưởng trong hình III.9 chúng tôi quyết định chọn nồng độ cysteamine là 200 mM và thời gian ngâm là 8h vì tại đây peak oxi hóa đạt giá trị cực đại và không đổi ngay cả sau 20 giờ ngâm, điều này có nghĩa là đơn lớp được hình thành tốt và ổn định.
(A) (B)
Hình III.10. Đường CV của chip sợi nano vàng sau mỗi bước hoạt hóa bề mặt trong dung dịch K3Fe(CN)6 trong PBS pH 4 đối với chất hoạt hóa là cysteamine (A) và DTSP (B)
Trong hình III.10 là đường quét của chip sợi nano vàng sau mỗi bước hoạt hóa bề mặt với cysteamine (A) và DTSP (B). Đối với trường hợp của cysteamine chúng ta có thể thấy rằng cường độ của peak oxi hóa tăng khi bề mặt vàng được hoạt hóa bởi cysteamine, điều này đã được giải thích ở trên, sau khi gắn lớp GAD thì peak oxi hóa giảm nhẹ, nguyên nhân là do gốc aldehyde (-CHO) là một gốc trung tính, nó không bị phân ly trong môi trường acid nhưng việc gắn thêm một lớp màng lên bề mặt điện cực làm tăng điện trở của điện cực. Sau khi được ngâm trong dung dịch enzyme chúng ta có thể thấy rằng peak oxi hóa tiếp tục giảm nhẹ. Nguyên nhân của sự giảm này là do lớp enzyme gắn lên làm tăng điện trở bề mặt của sợi nano, tuy nhiên do khi gắn enzyme cũng hình thành thêm các nhóm amine trên bề mặt điện cực do đó làm tăng khả năng thu hút các ion Fe(CN)63- tới bề mặt điện cực do đó peak oxi hóa chỉ giảm nhẹ mà không giảm mạnh mặc dù phân tử enzyme có thể tích lớn.
Đối với trường hợp bề mặt điện cực điện cực được hoạt hóa bởi DTSP, peak oxi hóa giảm khi điện cực được bao phủ bởi DTSP tương tự như trường hợp của GAD vì DTSP sau khi được gắn lên bề mặt điện cực thì bề mặt điện cực sẽ được chức năng hóa bởi nhóm chức -CHO là một nhóm chức trung tính do đó làm cho điện trở bề mặt của điện cực tăng, còn khi enzyme được gắn lên bề mặt điện cực thì cường độ của peak oxi hóa tăng mạnh do có sự hình thành của nhóm amine trên bề mặt điện cực. Sự tăng peak oxi hóa khi gắn enzyme trong trường hợp của DTSP khác với sự giảm trong trường hợp của cysteamine là do trước khi gắn enzyme thì điện cực đã được hoạt hóa bởi cysteamine với nhóm amine nên việc có thêm nhóm amine của enzyme không ảnh hưởng nhiều tới sự thay đổi peak oxi hóa.
Qua việc khảo sát tính chất bề mặt của điện cực sau các bước hoạt hóa bề mặt bởi phương pháp quét thế vòng tuần hoàn chúng ta có thể kết luận một cách định tính là enzyme cholesterol oxidase đã được gắn thành công lên bề mặt điện cực sử dụng 2 chất hoạt hóa là cysteamine và DTSP.
3.3 Xác định cholesterol
3.3.1 Xác định cholesterol bằng chip hoạt hóa bởi cysteamine
Trên hình III.11 là đường CV của chip sợi nano vàng với các nồng độ cholesterol khác nhau. Trên các đường CV này chúng tôi thu nhận được một peak oxi hóa ở vị trí E=0.9V, hơn thế nữa giá trị của peak oxi hóa này còn tẳng khi tăng nồng độ cholesterol, từ đó chúng tôi có thể đưa ra kết luận rằng đây chính là peak đặc trưng cho hàm lượng cholesterol trong dung dịch và điện cực sợi nano vàng với quy trình hoạt hóa bề mặt bằng cysteamine có thể được sử dụng để xác định cholesterol. Dựa vào peak oxi hóa thu được từ đường CV trong hình III.11.A chúng tôi đã xây dựng một đường đặc trưng của nồng độ cholesterol theo cường độ peak thu được và kết quả được thể hiện trên hình III.11.B. Từ đường đặc trưng này chúng tôi có thể kết luận là nồng độ cholesterol phu thuộc vào cường độ của peak thu được một cách tương đối tuyến tính trong khoảng nồng độ thực nghiệm từ 1 đến 7 mM với độ nhạy 8.7 nA/mM và chip sợi nano vàng được gắn enzyme bằng phương pháp hoạt hóa bề mặt bởi cysteamine có thể được ứng dụng làm cảm biến cholesterol cho các nghiên cứu về sau.