Vì kết quả đo giữa hai lần dung dịch có tế bào và buffer không có tế bào có sự khác biệt không đáng kể nên chƣa kết luận đƣợc SiNW FET có phát hiện đƣợc tế bào hay không. Để đánh giá lại kết quả đó chúng tôi tiến hành thêm các thí nghiệm trong điều kiện tƣơng tự và các tế bào đƣợc nhuộm huỳnh quang, việc này cho phép phát hiện vị trí của các tế bào. Các dung dịch chứa TBUTV đã đƣợc nhuộm huỳnh quang đƣợc đƣa lên bề mặt chíp SiNW FET và đƣợc quan sát qua kính hiển vi huỳnh quang (KHV) và các hình ảnh thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 4-6. Hình ảnh tế bào phân bố trên bề mặt chíp SiNW FET được nhìn qua KHV huỳnh quang độ phóng đại 5000 lần. Các đốm sáng là các tế bào UTV phát sáng, các đốm nhỏ trong hình vuông trắng là sợi Silic. Với thiết kế và kích thước đang được sử dụng của sợi Silic như quan sát được trên hình cho ta thấy xác suất để tế bào nằm vào vùng làm việc (vùng có khả năng kết cặp với các kháng thể trên sợi SiNW) là không lớn.
Quan sát qua KHV huỳnh quang cho thấy các tế bào UTV chỉ chuyển động trong một khoảng nhỏ. Trong khi kích thƣớc sợi Silic trong SiNW FET (loại tám sợi) chỉ trong khoảng 32×10µm nên khả năng tế bào UTV gặp đƣợc vùng làm việc của SiNW FET
(vùng có khả năng kết cặp với các kháng thể trên sợi) là rất thấp.
Chúng tôi cũng đã thực hiện nhiều biện pháp để tăng cƣờng độ linh động của TBUTV trong dung dịch đệm nhƣ sục khí, sử dụng các pipet để bơm khí vào, khuấy động dung dịch… Nhƣng các kết quả thu đƣợc cũng không đƣợc cải thiện đáng kể. Do thời gian có hạn để thực hiện luận văn, công việc phải tạm dừng ở giai đoạn này. Tuy thế các thiết kết với chiều dài sợi (tức là khoảng làm việc của cảm biến sau này) SiNW lớn hơn (trong khoảng vài trăm microns) sẽ đƣợc thiết kế lại, và các SiNW FET với kích thƣớc sợi dài hơn này sẽ đƣợc chế tạo trong thời gian tới. Việc sử dụng các chíp với vùng làm việc dài hơn sẽ tăng xác suất bắt cặp kháng nguyên của TBUTV- kháng thể, từ đó tăng độ nhạy và độ tin cậy của phép đo.
Qua quá trình khảo sát cho thấy rằng tăng độ linh động của TBUT trong dung dịch của quá trình đo đạc là một yếu tố rất quan trọng khác, giúp tăng khả năng kết cặp TBUT- kháng thể. Việc này có thể thực hiện bằng cách cho dung dịch chứa TBUT chạy liên tục qua bề mặt chíp. Tuy nhiên trong các phép đo hiện nay, do còn hạn chế về điều kiện nghiên cứu (chƣa có các bơm microfluidic thích hợp) các dung dịch đƣợc giữ trên bề mặt sợi SiNW ở thể tĩnh (bơm vào và giữ nguyên ở đó). Trong giai đoạn tiếp theo, chúng tôi sẽ trang bị các bơm nhu động microfluidic chuyên dụng để thực hiện công việc này.
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN
- Chỉ dùng kỹ thuật ăn mòn trong công nghệ chế tạo micro, chúng tôi đã chế tạo đƣợc sợi Silic kích thƣớc nano. Kết quả chế tạo cho thấy đã kiểm soát đƣợc quy trình chế tạo sợi SiNW bằng phƣơng pháp top down. Với những kỹ thuật ăn mòn màng mỏng, đặc biệt là kỹ thuật ăn mòn dị hƣớng tinh thể Silic <100> trên đế SOI kết hợp với các kỹ thuật quang khắc.
- Chíp chế tạo ra chứa nhiều SiNW FET đƣợc tích hợp, cho phép thực hiện nhiều phép phân tích trong cùng một thời điểm. Tính chất điện của sợi SiNW chế tạo ra đã đƣợc khảo sát. Sợi chế tạo đƣợc có độ dẫn điện tốt, không có các sai hỏng, các bẫy điện tử. Qui trình chế tạo cũng đã tạo đƣợc tiếp xúc ohmic tại các điện cực kim loại và sợi SiNW.
- Các quy trình chức năng hóa bề mặt sợi Silic (công bố bởi các nhóm nghiên cứu khác đã đƣợc tổng hợp, sử dụng để chức năng hóa bề mặt sợi nano để thụ động hóa các kháng thể trên bề mặt sợi. Tuy nhiên điều kiện thí nghiệm hiện nay (không chỉ tại PTN Công Nghệ Nano ĐHQG TPHCM, mà cả ở tất cả các đơn vị nghiên cứu khác trong nƣớc) đều còn rất hạn chế. Ví dụ nhƣ không có đơn vị nào có các thiết bị cần thiết có thể kiểm tra khả năng gắn kết của các chất kết nối gắn lên bề mặt sợi và cũng chƣa kiểm tra đƣợc mật độ gắn kết kháng thể anti-CK lên sợi.
- Ngoài ra trong quá trình thụ động hóa sử dụng ánh sáng UV bƣớc sóng 254nm phải cần các thiết bị, hệ hệ giữ và chứa chíp chuyên dụng làm bằng đá Thạch anh. Tuy nhiên các thiết bị này hiện cũng chƣa đƣợc trang bị, nên gây khó khăn và ảnh hƣởng đến tính chất lƣợng của cả quy trình.
- Các kết quả khảo sát cho thấy độ nhạy của SiNW FET là rất cao, ví dụ có thể ghi nhận đƣợc sự thay đổi dòng siêu nhỏ cỡ nA. Đây là ƣu việc rất quan trọng của SiNW FET, cho phép nó đƣợc sử dụng trong quá trình đo, phát hiện các đối tƣợng sinh học.
- Các kết quả nghiên cứu ban đầu trong việc phát hiện TBUTV bằng cảm biến SiNW cho thấy có sự thay đổi lớn về cƣờng độ dòng điện trƣớc và sau khi có dung dịch chứa tế bào. Để kiểm tra tính chính xác của kết quả đo, chúng tôi đã tiến hành cả các phép đo trong dung dịch đệm (không chứa tế bào) thì vẫn quan sát đƣợc sự thay đổi cua dòng điện qua sợi SiNW. Tuy sự thay đổi của dòng điện trong trƣờng hợp dung dịch không tế bào là nhỏ hơn các dòng điện thu đƣợc khi đo trong dung dịch có tế bào ung thƣ, nhƣng nếu chỉ dựa vào đó thì không thể khẳng định đƣợc việc tế bào có bị bắt giữ và phát hiện bởi các sợi Si của SiNW FET.
- Kính hiển vi huynh quang đã đƣợc sử dụng để nâng cao và đánh giá độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu. Tuy nhiên quan sát tế bào với kính hiển vi huỳnh quang
cho thấy tế bào không bị bắt tại các sợi Silic nhƣng vì quá trình này với quá trình đo điện không đồng thời nên không kết luận đƣợc rằng khi đo điện tế bào có đƣợc bắt giữ trên bề mặt sợi SiNW không. Dựa trên các kết quả nghiên cứu thu đƣợc chúng tôi nhận thấy rằng với việc sử dụng chíp có kích thƣớc nhƣ hiện nay (kích thƣớc vùng làm việc quá nhỏ) cùng với các hạn chế trong điều kiện thí nghiệm (không có bơm nhu động để bơm dung dịch liên tục qua bề mặt chíp) thì khả năng tế bào ung thƣ gặp đƣợc sợi Silic là rất thấp. Yêu cầu chế tạo các sợi nano dài hơn, để tăng cƣờng khả năng kết cặp TBUT- kháng thể là hết sức cần thiết.
- Cùng với lý do hạn chế về mặt hình học của SiNW FET nhƣ đề cập trên, còn một yếu tố nữa hạn chế kết quả nghiên cứu đó là tế bào có kích thƣớc lớn, chúng có khối lƣợng lớn hơn nhiều các phân tử trong dung dịch nên dạng tồn tại của tế bào ung thƣ rời rạc và ít chuyển động, nên khả năng gặp vùng làm việc SiNW FET về mặt động học là rất thấp. Do đó việc sử dụng các hệ bơm chuyên dụng để bơm dung dịch liên tục qua bề mặt chíp trong quá trình đo là hết sức cần thiết.
- Ứng dụng SiNW FET phát hiện tế bào ung thƣ vú là một chủ đề đang hết sức đƣợc quan tâm, nghiên cứu. Tuy nhiên lĩnh vực này cũng còn rất mới, hiện chƣa có công trình khoa học nào đƣợc công bố trong lĩnh vực ứng dụng SiNW FET phát hiện tế bào ung thƣ vú, nên chúng tôi không có điều kiện để đối chiếu và so sánh các kết quả nghiên cứu.
- Mặc dù chƣa đánh giá và khẳng định đƣợc khả năng phát hiện tế bào ung thƣ vú của cảm biến dựa trên SiNW FET, nhƣng các kết quả nghiên cứu của luận văn này đã chỉ ra các vấn đề cần phải giải quyết trong cả phần chế tạo sợi Silic nano cũng nhƣ quá trình đo đạc trong các nghiên cứu tiếp theo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1
Jemal, Ahmedin, Freddie Bray, Melissa M. Center, Jacques Ferlay, Elizabeth Ward, and David Forman. “Global Cancer Statistics.” CA: A Cancer Journal for Clinicians 61, no. 2 (March 2011): 69–90.
2Cristofanilli, M. “Circulating Tumor Cells: A Novel Prognostic Factor for Newly Diagnosed Metastatic Breast Cancer.” Journal of Clinical Oncology 23, no. 7 (January 31, 2005): 1420–1430.
3
Hou, Jian-Mei, Matthew Krebs, Tim Ward, Karen Morris, Robert Sloane, Fiona Blackhall, and Caroline Dive. “Circulating Tumor Cells, Enumeration and Beyond.” Cancers 2, no. 2 (June 9, 2010): 1236–1250.
4
Ashworth, T. R (1869). "A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death". Australian Medical Journal 14: 146–7
6
Zheng, Siyang, Henry Lin, Jing-Quan Liu, Marija Balic, Ram Datar, Richard J Cote, and Yu-Chong Tai. “Membrane Microfilter Device for Selective Capture, Electrolysis and Genomic Analysis of Human Circulating Tumor Cells.” Journal of Chromatography. A
1162, no. 2 (August 31, 2007): 154–161. 7
Cristofanilli M, Budd T, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Miller MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LWMM, Hayes DF (2004) Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 351:781–791
8
Nagrath, Sunitha, Lecia V. Sequist, Shyamala Maheswaran, Daphne W. Bell, Daniel Irimia, Lindsey Ulkus, Matthew R. Smith, et al. “Isolation of Rare Circulating Tumour Cells in Cancer Patients by Microchip Technology.” Nature 450, no. 7173 (December 20, 2007): 1235–1239.
9
)Wang, Shutao, Hao Wang, Jing Jiao, Kuan-Ju Chen, Gwen E Owens, Ken-ichiro Kamei, Jing Sun, et al. “Three-dimensional Nanostructured Substrates Toward Efficient Capture of Circulating Tumor Cells.” Angewandte Chemie (International Ed. in English) 48, no. 47 (2009): 8970–8973.
10
Cui, Y., Qingqiao W., Hongkun, P. & Lieber, C. M. Nanowire nanosensors for highly sensitive and selective detection of biological and chemical species. Science 293, 1289– 1292 (2001).
11
Gengfeng Zheng, Fernando Patolsky, Yi Cui, Wayne U Wang, and Charles M Lieber. “Multiplexed Electrical Detection of Cancer Markers with Nanowire Sensor Arrays.”
Nature Biotechnology 23, no. 10 (September 18, 2005): 1294–1301.
12Ferrari, Mauro. “Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges.” Nature Reviews.
13
Curreli, M., Rui Zhang, F.N. Ishikawa, Hsiao-Kang Chang, R.J. Cote, Chongwu Zhou, and M.E. Thompson. “Real-Time, Label-Free Detection of Biological Entities Using Nanowire-Based FETs.” IEEE Transactions on Nanotechnology 7, no. 6 (November 2008): 651–667.
14
Jan Linnros, Project proposal to K A Wallenberg Foundation 2011, Droplet microfluidics and functionalised nanowires for detection of circulating tumour cells.
15Cristofanilli, M. “Circulating Tumor Cells: A Novel Prognostic Factor for Newly Diagnosed Metastatic Breast Cancer.” Journal of Clinical Oncology 23, no. 7 (January 31, 2005): 1420–1430.
16
Cristofanilli, Massimo, Kristine R Broglio, Valentina Guarneri, Summer Jackson, Herbert A Fritsche, Rabiul Islam, Shaheenah Dawood, et al. “Circulating Tumor Cells in Metastatic Breast Cancer: Biologic Staging Beyond Tumor Burden.” Clinical Breast
Cancer 7, no. 6 (February 2007): 471–479.
17
de Bono, J. S., H. I. Scher, R. B. Montgomery, C. Parker, M. C. Miller, H. Tissing, G. V. Doyle, L. W.W.M. Terstappen, K. J. Pienta, and D. Raghavan. “Circulating Tumor Cells Predict Survival Benefit from Treatment in Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer.” Clinical Cancer Research 14, no. 19 (October 1, 2008): 6302–6309.
18
Marx J (2007) Cancer’s perpetual source. Science 24:1029–1034.
19Sheehan, Paul E., and Lloyd J. Whitman. “Detection Limits for Nanoscale Biosensors.”
Nano Letters 5, no. 4 (April 2005): 803–807.
20
Elfström, Niklas, Robert Juhasz, Ilya Sychugov, Torun Engfeldt, Amelie Eriksson Karlström, and Jan Linnros. “Surface Charge Sensitivity of Silicon Nanowires: Size Dependence.” Nano Letters 7, no. 9 (September 2007): 2608–2612.
21
A. Kim, C. S. Ah, H. Y. Yu, J. H. Yang, I. B. Baek, C. G. Ahn, C.W. Park, M. S. Jun, and S. Lee, “Ultrasensitive, label-free, and real-time immunodetection using Silicon field- effect transistors,” Appl. Phys. Lett.,vol. 91, pp. 103901-1–103901-3, 2007.
22
Gasparini, Giampietro, and Daniel Hayes. Biomarkers in breast cancer molecular
diagnostics for predicting and monitoring therapeutic effect. Table 2 pag 219. Totowa,
N.J.: Humana Press, 2006. 23
Bunimovich, Yuri L., Young Shik Shin, Woon-Seok Yeo, Michael Amori, Gabriel Kwong, and James R. Heath. “Quantitative Real-Time Measurements of DNA Hybridization with Alkylated Nonoxidized Silicon Nanowires in Electrolyte Solution.”
Journal of the American Chemical Society 128, no. 50 (December 2006): 16323–16331.
24Buriak, Jillian M. “Organometallic Chemistry on Silicon and Germanium Surfaces.”
25Lacroix, Marc, and Guy Leclercq. “Relevance of Breast Cancer Cell Lines as Models for
Breast Tumours: An Update.” Breast Cancer Research and Treatment 83, no. 3 (February 2004): 249–289.