2.5.1 Nguyên tắc xác định gen halothane
Gen halothane có hai alen N và n hình thành 3 kiểu gen NN, Nn và nn. Bằng việc so sánh trình tự nucleotide của gen này, MacLennan thấy rằng có sự đột biến C (cytosin) thành T (thymin) ở vị trí base 1843 của chuỗi nucleotide. Fujii và ctv (1991) đã đƣa ra phƣơng pháp phát hiện gen halothane bằng kỹ thuật PCR và enzyme cắt giới
hạn Hha I để phát hiện đột biến điểm trên bất kỳ loại tế bào nào có chứa DNA. Sau đó, kỹ thuật này đƣợc Hughes và ctv (1992) cải tiến. Phƣơng pháp này phân biệt dễ dàng các kiểu gen NN, Nn và nn (Nguyễn Thị Thu Phƣơng, 2004).
2.5.2. Những công trình nghiên cứu halothane ở trong nƣớc
Theo Nguyễn Ngọc Tuân (1996), tần số nhạy cảm với halothane khác nhau giữa các quốc gia. Hầu hết các dòng Yorkshire Large White có tần số nhạy cảm rất thấp hoặc bằng không, Pietrain và Landrace Bỉ có tần số nhạy cảm cao nhất, các dòng Landrace khác có tần số nhạy cảm stress trung gian giữa Yorkshire và Pietrain.
Kết quả nghiên cứu của Đinh Văn Chỉnh và ctv (1999) cho rằng heo nái Landrace và Yorkshire, kiểu gen halothane có ảnh hƣởng đến các chỉ tiêu sinh sản, nhất là các chỉ tiêu về độ lớn của lứa đẻ và qua đó ảnh hƣởng đến khối lƣợng của toàn ổ.
Theo Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân (2000), với kiểu gen nn, nọc có sức sản xuất tinh kém nhất, nái có thời gian chờ phối dài hơn và số con sơ sinh/ổ kém hơn so với 2 kiểu gen NN và Nn. Heo Nn có tăng trọng và dày mỡ lƣng trung gian giữa NN và nn.
Phan Xuân Hảo (2001) cho rằng kiểu gen halothane ảnh hƣởng rõ rệt đối với chỉ tiêu số con/ổ ở nái Landrace, có ảnh hƣởng nhƣng không rõ rệt đối với nái Yorkshire.
2.5.3 Những công trình nghiên cứu halothane ở nƣớc ngoài
Kết quả nghiên cứu của Webb và ctv (1981) và nhiều tác giả (Pommier và cs, 1992; Wittmann và ctv, 1993; Berger và cs, 1994) cho thấy heo đồng hợp tử lặn nn cho tỷ lệ thịt xẻ, tỷ lệ nạc, diện tích thịt thăn lớn hơn và dày mỡ lƣng thấp hơn heo mang kiểu gen NN, Nn. Song tỷ lệ thịt PSE cao nhất ở heo mang kiểu gen nn. Tổng hợp những tính trạng này các tác giả nhận định rằng kiểu gen Nn mang tính trạng trung gian giữa kiểu gen NN và nn nên đem lại lợi ích kinh tế cao hơn kiểu gen NN, nn.
Kết quả nghiên cứu của Webb và Jordan (1978); Schneider và ctv (1980); Willeke và ctv (1984) cho rằng nái không nhạy cảm với halothane (NN, Nn) đẻ nhiều hơn so với nái nhạy cảm với halothane (nn) từ 0,1 – 1,1 con/ổ, sự khác biệt thể hiện rõ số con cai sữa hơn là số con sinh ra. Trong suốt đời nái, nái có kiểu gen NN, Nn đẻ
16
nhiều hơn nái có kiểu gen nn 1,02 lứa (Willeke, 1986). Lengerken và ctv (1982) cho biết lợn có phản ứng halothane âm tính có thành tích cao hơn so với lợn có phản ứng halothane dƣơng tính về tổng số con đẻ ra/ổ (0,3 con), số con đẻ ra có khả năng chăn nuôi/ổ (0,9 con) và số lứa đẻ/năm (0,17 lứa).
Bằng những công trình nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nƣớc cho thấy rằng gen halothane đã có ảnh hƣởng lớn đến năng suất sinh sản và chất lƣợng thịt. Vì vậy, việc nghiên cứu tính nhạy cảm stress nói chung và tính năng sản xuất của heo có các kiểu gen halothane khác nhau nói riêng đã đƣợc tiến hành từ những năm 70 cho đến nay vẫn là một vấn đề rất đƣợc quan tâm.
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu
3.1.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo
(1) Khảo sát nồng độ proteinase K (2) Khảo sát nồng độ DTT
(3) Khảo sát nồng độ CTAB
3.1.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA cho các vị trí khác nhau của lông
(1) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu gốc lông (2) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu thân lông (3) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu ngọn lông
(4) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu cả sợi lông
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng Công Nghệ Sinh Học Động Vật – Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM, từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2007.
3.3. Vật liệu
3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA
Mẫu lông heo đƣợc lấy từ một cơ sở giết mổ ở Dĩ An - Bình Dƣơng.
3.3.2. Đoạn mồi
Đoạn mồi của gen halothane
Trình tự mồi xuôi: 5' – CTT CCC ACC CTG GGT CTT – 3' Trình tự mồi ngƣợc: 5' – AGG CAG AGC CAT GGA GAC – 3' 3.3.3. Hóa chất dùng trong đề tài
- Hoá chất ly trích DNA + Buffer ly trích
NaCl 8 mM, Tris-HCl (pH 8,0) 8 mM, SDS 1%, EDTA (pH 8,0) 1,6 mM, DTT 50 mM, proteinase K 0,8 mg/ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
18
Phenol (pH 8,0), phenol-chloroform (1:1), cloroform, CTAB 2% + Thu hồi DNA
NaCl 0,2 M; NaCl 1,2 M, sodium acetate 3 M, ethanol tuyệt đối lạnh + TE buffer 1 X, Tris-HCl 100 mM, EDTA( pH 8,0) 1 mM
- Hoá chất phản ứng PCR
PCR buffer 1 X, MgCl2 2 mM, mỗi dNTP 200 µM, mồi xuôi 0,5 µM, mồi ngƣợc 0,5 µM, Taq DNA polymerase 1 UI
- Hoá chất chạy điện di sản phẩm PCR + Agarose 2%
+ TBE (Tris borate EDTA) (pH = 8,3) 1 X
Tris-base 89 mM, acid boric 89 mM, Na2EDTA 2,5 mM + Loading dye
Bromophenol blue 0,3%, sucrose 40%, TE 1 X vừa đủ 100% + Ethidium bromide 10 mg/ml
3.3.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài
3.3.4.1. Dụng cụ
- Micropipet loại 100 – 1000 µl; 10 – 100 µl; 0,5 – 10 µl - Đầu tip tƣơng ứng với các loại micropipet
- Eppendorf loại 0,2 ml và 1,5 ml - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu - Dụng cụ kéo, kẹp, chày, cối
- Ống falcon loại 14 ml; 50 ml 3.3.4.2. Thiết bị - Máy vortex - Máy ly tâm - Máy PCR - Bộ điện di - Máy chụp gel - Tủ ấm
- Tủ trữ mẫu - Tủ trữ hoá chất - Microwave - Cân - Tủ sấy - Máy cất H2O khử ion - Autoclave - Máy đo OD - Bình N2 lỏng - Tủ lạnh -200C và -700 C 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Lấy và trữ mẫu
Lấy mẫu ở lò mổ, xử lí mẫu bằng cách rửa trong nƣớc vô trùng, sau đó rửa trong cồn 70%. Đặt mẫu vào bao nylon, dán kín miệng bao và cho vào thùng đá đem về phòng thí nghiệm.
Tại phòng thí nghiệm, cắt khoảng 1cm tính từ chân gốc lông trở lên để có mẫu gốc lông, phần còn lại là mẫu ngọn lông. Đối với mẫu thân lông thì lấy khoảng 1cm đoạn giữa sợi lông đã đƣợc cắt bỏ phần nang nằm dƣới da và phần ngọn lông. Đối với mẫu sợi lông thì giữ nguyên cả sợi lông. Mỗi loại mẫu đƣợc đặt trong từng bao nylon riêng biệt, dán nhãn và trữ ở tủ -700C.
Cân 0,1 g mẫu cho vào cối sành vô trùng. Cho N2 lỏng vào cối, dùng chày sành vô trùng nghiền lông thành dạng bột. Chú ý nghiền nhanh tay và thƣờng xuyên châm thêm nitơ lỏng để tránh cho lông bị chảy nƣớc. Chuyển nhanh chóng bột lông từ cối vào eppendorf 1,5 ml. Đánh dấu từng loại mẫu gốc, ngọn, thân và sợi lông. Đặt eppendorf chứa bột lông trong N2 lỏng hoặc trữ ở tủ -70oC ngay sau đó.
20
Hình 3.4. Phân chia các vị trí lấy mẫu trên sợi lông heo 3.4.2. Tách chiết DNA
Quy trình tách chiết DNA từ lông đƣợc tham khảo từ Nozawa và cs (1999). Mỗi eppendorf chứa bột lông (0,1 g) đƣợc cho thêm 300 µl buffer ly trích gồm: Tris–HCl (pH 8,0) 8 mM, NaCl 8 mM, EDTA 1,6 mM, SDS 1%, DTT 50 mM và proteinase K 0,8 mg/ml. Ủ hỗn hợp ở 37oC qua đêm.
Tinh sạch DNA: Thêm 300 µl phenol (pH 8,0) vào mẫu. Vortex mạnh. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Hút lớp trên cho vào eppendorf sạch khác. Hút cẩn thận tránh cuốn theo protein ở lớp dƣới. Thêm vào mẫu 1 thể tích phenol–chloroform đúng bằng thể tích vừa hút ra. Vortex. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Lặp lại bƣớc này 1 lần nữa. Hút lớp trên cho vào eppendorf sạch khác. Thêm vào mẫu 1 thể tích chloroform đúng bằng thể tích vừa hút ra. Vortex. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Hút lớp trên cho vào eppendorf sạch khác. Thêm CTAB và NaCl để nồng độ cuối cùng của CTAB đạt 0,2% và NaCl đạt 0,02 M. Đảo nhẹ. Để 15 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Lấy tủa.
Thu hồi DNA: Thêm 300 µl NaCl 1,2 M; 150 µl sodium acetate 2 M, 1.000 µl ethanol tuyệt đối lạnh. Ủ 2 giờ. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Lấy tủa. Làm khô tủa. Thêm 100 µl TE 1 X.
} gốc lông (1 cm)
Quy trình trên là quy trình tham khảo. Từ đó, tiến hành các thí nghiệm nhƣ mô tả bên dƣới để tìm quy trình ly trích DNA từ lông phù hợp.
3.4.2.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo
Để thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo ổn định và hiệu quả, một số yếu tố đã đƣợc khảo sát để tìm ra quy trình tối ƣu.
* Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K
Proteinase K có tác dụng phân hủy keratin (một thành phần protein chính của lông) và bảo vệ những acid nucleic bằng cách phá hủy enzyme ribonuclease (McNevin và cs, 2005). Thí nghiệm 1 đƣợc bố trí nhằm khảo sát khả năng phân cắt keratin của proteinase K ở các nồng độ khác nhau. Thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình 1 sử dụng proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml; quy trình 2 sử dụng proteinase K nồng độ 1 mg/ml và quy trình 3 sử dụng proteinase K nồng độ 1,2 mg/ml (các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong quy trình tham khảo). Các bƣớc tiến hành theo quy trình tham khảo. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lông heo. Số mẫu đƣợc khảo sát là 4 cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane khi sử dụng DNA ly trích từ lông theo quy trình này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT
Ngoài proteinase K có khả năng cắt phân tử keratin thì DTT cũng có khả năng phân cắt keratin tốt. Theo Manual của Biorad (2005), DTT có khả năng cắt đứt nối S–S trong phân tử cystein của keratin. Thí nghiệm 2 đƣợc bố trí nhằm mục tiêu khảo sát xem nồng độ nào của DTT thì cho DNA chất lƣợng tốt . Thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình ly trích 1 sử dụng DTT với nồng độ 50 mM; quy trình 2 sử dụng DTT với nồng độ 65 mM và quy trình 3 sử dụng DTT với nồng độ 80 Mm. Sử dụng proteinase K theo nồng độ đã cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 1. Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong thí nghiệm 1. Các bƣớc thực hiện giống nhƣ thí nghiệm 1. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi và sản phẩm PCR xác định gen halothane. Mẫu sử dụng là mẫu gốc lông heo. Số mẫu thí nghiệm là 4 mẫu cho mỗi quy trình.
22
* Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB
DTT chỉ phân cắt keratin mà không có khả năng loại bỏ đƣợc melanin. Theo Giambernardi và cs (1998), melanin làm ức chế phản ứng PCR. Theo Nozawa và cs (1999), CTAB có thể loại bỏ melanin ra khỏi DNA ly trích. Do đó, thí nghiệm 3 đƣợc bố trí để so sánh chất lƣợng DNA ly trích giữa 3 quy trình: quy trình 1 không sử dụng CTAB; quy trình 2 sử dụng CTAB nồng độ 0,1% và quy trình 3 sử dụng CTAB nồng độ 0,2%. Sử dụng DTT theo nồng độ đã cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 2. Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong thí nghiệm 2. Các bƣớc đƣợc thực hiện theo trình tự của thí nghiệm 2. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lông heo. Số mẫu đƣợc khảo sát là 4 cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane.
3.4.2.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của lông heo
Để khảo sát xem quy trình ly trích tối ƣu đƣợc rút ra từ những thí nghiệm trên sẽ cho kết quả tốt nhất trên vị trí nào của lông heo, thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ mô tả bên dƣới.
* Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên các vị trí khác nhau của lông
Thí nghiệm 4 đƣợc tiến hành nhằm khảo sát hiệu quả của việc tách chiết DNA theo quy trình tối ƣu trên đối với các vị trí khác nhau của lông. Từ đó rút ra vị trí tốt nhất trên lông để ly trích DNA. Thí nghiệm 4 đƣợc thực hiện theo các trình tự của quy trình tham khảo với nồng độ proteinase K, nồng độ DTT, nồng độ CTAB đã cho kết quả ly trích DNA tốt nhất qua các thí nghiệm trên. Thí nghiệm 4 đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Có 4 lô thí nghiệm: lô 1 gồm 10 mẫu gốc lông, lô 2 gồm 10 mẫu thân lông, lô 3 gồm 10 mẫu ngọn lông và lô 4 gồm 10 mẫu cả sợi lông (vị trí lông đƣợc phân chia theo hình 3.4). Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane.
3.4.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
DNA sau khi ly trích đƣợc đo bằng máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Độ tinh sạch của DNA đƣợc tính bằng tỷ số OD260nm/OD280nm. DNA đƣợc xem là sạch nếu tỷ số khoảng 1,8 – 2,0.
Hàm lƣợng DNA đƣợc tính bằng công thức: DNA (ng/µl) = (62,9*OD260nm – 36*OD280nm)* độ pha loãng. Mẫu đƣợc pha loãng 100 lần theo tỷ lệ 10 µl DNA gốc: 990 µl H2O khi đo OD.
3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR
DNA sau khi đƣợc ly trích từ lông heo theo các quy trình trên đƣợc sử dụng làm mẫu để thực hiện PCR xác định gen halothane. Kết quả PCR sẽ là một trong những chỉ tiêu để đánh giá chất lƣợng DNA ly trích. Quy trình PCR xác định gen halothane đƣợc tham khảo từ Lƣơng Quý Phƣơng (2006).
Bảng 3.4. Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối PCR buffer 5 X 1 X MgCl2 25 mM 2 mM F/ R primer 100 µM 0,5 µM dNTP 25 mM 200 µM/ mỗi loại
Taq polymerase 5 UI/µl 1 UI
DNA 150 ng
H2O cất vừa đủ 30 µl
(Nguồn: Lƣơng Quý Phƣơng, 2006)
Bảng 3.5. Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane
(Nguồn: Lƣơng Quý Phƣơng, 2006)
Tên giai đoạn Nhiệt độ (o
C) Thời gian
Biến tính hoàn toàn 94 5 phút
35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 54 72 45 giây 90 giây 90 giây
Kéo dài cuối cùng 72 5 phút
24
3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose
Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định gen halothane là 2%. Ví dụ cần 100 ml dung dịch agarose 2%, tiến hành nhƣ sau:
- Cân 2 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 0,5 X - Đun sôi hỗn hợp trên trong 3 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Để nguội dần ở nhiệt độ phòng, đến khi vừa ấm là đƣợc
- Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ), chú ý tránh bọt khí - Để cho gel cứng hoàn toàn, rút lƣợc ra khỏi gel. Cho gel vào bể điện di, bổ sung thêm TBE cho ngập bản gel là đƣợc.
- Trộn 10 sản phẩm PCR với 2 loading dye và bơm hỗn hợp vào các giếng gel. Vận hành máy điện di với các thông số 100 V, 250 mA, 30 phút.
- Sau khi điện di, ngâm gel trong ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút.
3.4.5.2. Đọc kết quả
Điện di 7,5 µl sản phẩm PCR trong 30 phút với TBE 0,5 X ; dòng điện 100 V; 250 mA. Vớt gel ra khỏi buồng diện di và cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 10 mg/ml