3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose
Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định gen halothane là 2%. Ví dụ cần 100 ml dung dịch agarose 2%, tiến hành nhƣ sau:
- Cân 2 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 0,5 X - Đun sôi hỗn hợp trên trong 3 phút
- Để nguội dần ở nhiệt độ phòng, đến khi vừa ấm là đƣợc
- Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ), chú ý tránh bọt khí - Để cho gel cứng hoàn toàn, rút lƣợc ra khỏi gel. Cho gel vào bể điện di, bổ sung thêm TBE cho ngập bản gel là đƣợc.
- Trộn 10 sản phẩm PCR với 2 loading dye và bơm hỗn hợp vào các giếng gel. Vận hành máy điện di với các thông số 100 V, 250 mA, 30 phút.
- Sau khi điện di, ngâm gel trong ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút.
3.4.5.2. Đọc kết quả
Điện di 7,5 µl sản phẩm PCR trong 30 phút với TBE 0,5 X ; dòng điện 100 V; 250 mA. Vớt gel ra khỏi buồng diện di và cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút. Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả với phần mềm Geldoc của Biorad.
3.5. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu với các hàm thống kê F trong Excel và phần mềm Statgraphics 7,0. Kết quả đƣợc trình bày ở dạng X± SE (Với SE = SD/√n ).
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K
Sử dụng mẫu gốc lông để ly trích DNA. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K
Chỉ tiêu Nồng độ proteinase K P 0,8 mg/ml 1 mg/ml 1,2 mg/ml Tỷ số OD 1,84 0,03 1,82 0,03 1,75 0,03 1,71 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,32 0,02 0,33 0,03 0,32 0,03 0,28 Số mẫu 4 4 4 1,84 1,82 1,75 0,32 0,33 0,32 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0,8 mg/ml 1 mg/ml 1,2 mg/ml nồng độ proteinase K Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K
McNevin và cs (2005) đã đƣa ra khoảng nồng độ proteinase K sử dụng trong dung dịch đệm ly trích DNA của lông là từ 0,05 đến 20 mg/ml. Qua bảng 4.1 cho thấy không có sự khác biệt về tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi ở các nồng độ 0,8 mg/ml; 1 mg/ml và 1,2 mg/ml (P > 0,05). Phản ứng PCR từ các mẫu trên đều thành
26
công. Do đó, khi tiến hành các thí nghiệm ly trích DNA từ lông, có thể dùng buffer ly trích chứa proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml để có lợi về mặt kinh tế.
1 2 3 4
Hình 4.1. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ proteinase K 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT
Sau khi đo OD và tính hàm lƣợng DNA thu hồi đƣợc từ các mẫu gốc lông đem thí nghiệm, chúng tôi tính toán các giá trị thống kê (xem bảng 4.2).
Bảng 4.2. Kết quả tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT
Chỉ tiêu Nồng độ DTT P 50 mM 65 mM 80 mM Tỷ số OD 1,65 0,02 1,81 0,09 1,64 0,03 1,67 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,36 0,08 0,43 0,04 0,29 0,03 0,40 Số mẫu 4 4 4 1,65 1,81 1,64 0,36 0,43 0,29 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 50 mM 65 mM 80 mM nồng độ DTT Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.2. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT 586 bp
1: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 0,8 mg/ml 2: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 1 mg/ml 3: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 1,2 mg/ml 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ)
Không có sự khác biệt về tỷ số OD giữa việc sử dụng DTT ở các nồng độ 50 mM, 65 mM và 80 mM (P > 0,05). Phản ứng PCR gen halothane thành công ở mẫu có sử dụng nồng độ DTT 50 mM nhƣng không thành công với những mẫu ly trích từ hai nồng độ còn lại. Sự hiện diện của DTT trong dung dịch đệm ly trích làm giảm rõ rệt lƣợng DNA ly trích (Kalbe và cs, 1988) và điều này có thể làm giảm việc gắn kết giữa các deoxyribose nucleotides trong DNA, làm chúng không thể đƣợc nhận biết bởi Taq
polymerase (McNevin và ctv, 2005). Đó có thể là giả định giải thích tại sao phản ứng PCR không xảy ra đối với mẫu sử dụng nồng độ DTT 65 mM và 80 mM. Do đó, trong buffer ly trích DNA từ lông nên sử dụng DTT nồng độ 50 mM để cho DNA có chất lƣợng tốt.
1 2 3 4
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.2. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ DTT 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên mẫu gốc lông. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA thu hồi đƣợc trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB
Chỉ tiêu Nồng độ CTAB P 0% 0,1% 0,2% Tỷ số OD 1,39 0,02 a 1,53 0,03 b 1,80 0,02 c 0,03 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,32 0,02 0,37 0,03 0,33 0,04 0,31 Số mẫu 4 4 4 586 bp 1: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 50 mM 2: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 65 mM 3: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 80 mM 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ)
28 1,39 1,53 1,8 0,32 0,37 0,33 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0% 0,10% 0,20% nồng độ CTAB Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB
Có sự khác biệt giữa tỷ số OD giữa các quy trình ly trích sử dụng CTAB ở các nồng độ 0%, 0,1% và 0,2% (P < 0,05). Sử dụng CTAB ở nồng độ 0,2% cho tỷ số OD cao nhất. Phản ứng PCR thành công đối với mẫu có sử dụng CTAB ở nồng độ 0,2%. Theo Nozawa và cs (1999), CTAB có khả năng loại bỏ melanin ra khỏi hỗn hợp mẫu lông. Ở những mẫu không sử dụng CTAB và những mẫu có sử dụng CTAB 0,1%, có lẽ nồng độ CTAB sử dụng không đủ để loại hết thành phần melanin trong hỗn hợp mẫu lông. Theo Sambrook và ctv (2001), độ tinh sạch của DNA ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả PCR. DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 đƣợc xem là sạch. Ở đây, mẫu không dùng CTAB và mẫu dùng CTAB 0,1% có tỷ số OD trung bình là 1,39 và 1,53. Tỷ số này thấp, chứng tỏ lƣợng protein trong dịch DNA còn nhiều. Đó có thể là lý do giải thích cho những phản ứng PCR không thành công ở mẫu không sử dụng CTAB và mẫu sử dụng CTAB 0,1%. Do đó, trong buffer ly trích DNA từ lông nên sử dụng CTAB nồng độ 0,2%.
1 2 3 4
Hình 4.3. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ CTAB
4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên các vị trí khác nhau của lông
Thí nghiệm đƣợc bố trí trên các lô mẫu gốc lông, thân lông, ngọn lông và cả sợi lông heo. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.4a.
Bảng 4.4a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lông heo
Chỉ tiêu Mẫu p Gốc Thân Ngọn Cả sợi Tỷ số OD 2,05±0,15 a 1,84±0,15 b 1,40±0,15 c 1,75±0,15 b 0,04 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,33±0,15 a 0,30±0,15 ab 0,24±0,15 c 0,28±0,15 b 0,03 Số mẫu 10 10 10 10 2,05 1,84 1,4 1,75 0,33 0,3 0,24 0,28 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Gốc Thân Ngọn Sợi Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí lông heo
586 bp
1: Mẫu gốc lông không sử dụng CTAB 2: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,1% 3: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,2% 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ)
30
Qua bảng 4.4a cho thấy có sự khác biệt về tỷ số OD trên các vị trí khác nhau của lông heo (P < 0,05). Vị trí cho tỷ số OD tốt nhất là mẫu gốc lông (2,05), tiếp theo là mẫu thân lông (1,84), vị trí cho tỷ số OD thấp nhất là mẫu ngọn lông (1,40), vị trí cho tỷ số OD chấp nhận đƣợc là cả sợi lông (1,75). Nguyên nhân có thể là do mức độ keratin hóa ở gốc ít hơn ở ngọn cho nên việc tách keratin ra khỏi hỗn hợp DNA ly trích từ gốc dễ dàng hơn so với phần ngọn.
Kết quả cho thấy hàm lƣợng DNA thu hồi từ mẫu gốc lông đạt cao nhất (0,33 µg/µl). Trong khi đó, mẫu thân lông đạt 0,3 µg/µl, mẫu cả sợi lông đạt 0,28 µg/µl và mẫu ngọn lông là thấp nhất (0,26 µg/µl). Sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Nguyên nhân có thể là do phần lớn tế bào ở ngọn lông là tế bào chết nên mất hết DNA, vì thế lƣợng DNA thu hồi sẽ ít hơn so với lƣợng DNA thu hồi từ gốc và thân lông (nơi có nhiều tế bào còn sống).
Bảng 4.4b. Kết quả PCR từ các vị trí lông heo Mẫu Số mẫu tiến hành
PCR Số mẫu có sản phẩm PCR Tỷ lệ mẫu có sản phẩm PCR (%) P Gốc lông 10 7 70 0,03 Thân lông 10 6 60 Ngọn lông 10 0 0 Sợi lông 10 5 50
Qua bảng 4.4b cho thấy DNA ly trích từ mẫu gốc lông cho tỷ lệ thành công của phản ứng PCR cao nhất (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và mẫu cả sợi lông (50%). Mẫu ngọn lông do tỷ số OD còn quá thấp nên phản ứng PCR không xảy ra (tỷ lệ PCR thành công là 0%). Sự khác biệt này là có ý nghĩa (p < 0,05). Trong các nghiên cứu sử dụng mẫu lông của thú sống, việc nhổ cả sợi lông trên mình thú với số lƣợng lớn sẽ dễ làm cho thú bị stress, ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và sinh sản của thú. Để giải quyết vấn đề này, chúng ta có thể dùng dao cắt những sợi lông ngay trên bề mặt da thú rồi áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu thân lông.
Nhƣ vậy, ly trích DNA từ gốc lông và thân lông sẽ cho DNA chất lƣợng tốt hơn so với cả sợi lông và ngọn lông. Trong trƣờng hợp thú sống, sử dụng mẫu thân lông để ly trích DNA thì thích hợp hơn cả. Do vậy, có thể xem thân lông là vị trí thích hợp để ly trích DNA.
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.4a. Kết quả PCR vị trí gốc lông
1 2 3 4 5 6 7 8
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.4b. Kết quả PCR vị trí thân lông
586 bp
586 bp
1->7: Các mẫu gốc lông
8: Mẫu ĐC (DNA đƣợc ly trích từ cơ)
1->7: Các mẫu thân lông
32
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.4c. Kết quả PCR vị trí cả sợi lông
586 bp
1->7: Mẫu sợi lông
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ởcác nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84.
- DNA đƣợc ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR.
- Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan ở nồng độ này.
- Vị trí gốc lông cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lông (OD = 1,84), cả sợi lông (OD = 1,75),vị trí ngọn lông (OD = 1,4). Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông.
5.2. Đề nghị
- Tiếp tục cải thiện quy trình ly trích DNA từ lông để cho hiệu suất PCR cao nhất.
- Sử dụng thân lông (đoạn 1 cm kể từ da thú trở lên) dùng làm nguyên liệu ly trích DNA.
- Áp dụng quy trình ly trích DNA từ lông này lên các loài thú khác nhau, kể cả với lông ngƣời trong những lĩnh vực có liên quan.
34
PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu Tiếng Việt *Tài liệu Tiếng Việt
1. Bùi Thị Ngọc Bích, 2006. Sử dụng một số hóa chất để cải thiện hiệu quả ly trích
DNA từ lông. Khóa luận tốt nghiệp, ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại
học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
2. Đinh Văn Chỉnh và ctv, 1999. Xác định tần số kiểu gen và tính năng sản xuất của lợn Landrrace và Yorshire có các kiểu gen khác nhau đƣợc nuôi ở một số cơ sở giống miền Bắc. Báo cáo Khoa học – NXB Nông Nghiệp.
3. Lê Thị Thu Hà, 2006. Chọn lọc đàn giống hạt nhân qua đánh giá giá trị giống kết hợp với phân tích gen estrogen (Esr), halothane (Hal). Đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông nghiệp miền Nam, Việt Nam.
4. Lê Thị Thu Phƣơng, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối
liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
5. Lƣơng Quý Phƣơng, 2006. Sản xuất bộ kit ly trích DNA và kit phát hiện gen halothane trên heo. Khóa luận tốt nghiệp, ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
6. Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân, 2000. Vài kinh nghiệm ứng dụng PCR để phát hiện gen halothane và gen thụ thể estrogen , mối quan hệ giữa hai gen này với sức sản xuất của nái, nọc và heo thịt. Hội nghị KH chuyên ngành Chăn nuôi -Thú y.
7. Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân, 2005. Ảnh hƣởng của gen halothane, gen thụ thể estrogen đến năng suất sinh sản và phẩm chất thịt. Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, số 2&3/2005.
8. Nguyễn Văn Út, 2005. Xác định giới tính bằng kỹ thuật multiplex PCR trên 3
giống bò. Khóa luận tốt nghiệp,ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học
*Tài liệu Tiếng Anh
9. DeSilva U., Guo X., Kupfer D.M., Fernando S.C., Pillai A.T.V., F. Z., Najar S. So, Fitcha G.Q., Roeb B.A., 2003. Allelic variants of ovine prion protein gene (PRNP) in Oklahoma sheep. Cytogenet Genome Res 102: 89 – 94.
10. Elizabeth A. G, David R. F., 2005. A simplified method for mitochondrial DNA extraction from head hair shafts. J. Forensic Sci 50: 5.
11. Galan M., Baltzinger C., Hewison A. J. M., Cosson J., 2003. Deer species identification using DNA extracted from hair samples and the polymerase chain reaction (PCR) method. Trends in Ecology and Evolution 12: 223 – 227.
12. Haase A., Retzel E. F., Stakus K. A., 1990. Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells. Proc. Natl Acad. SCUSA 87: 4971 – 4975.
13. Pfeiffer, I. Volkel, H. Taubert, B. Brenig, 2004. Forensic DNA-typing of dog hair: DNA-extraction and PCR amplification. Forensic Science International
141: 149 – 151.
14. James N. J., Mary V. A., 2004. Genetic variability and population differentiation in Captive Baird’s Tapirs (Tapirus bairdii). Zoo Biology 23: 521– 531.
15. Mark R. Wilson, Joseph A. DiZinno, Deborah Polanskey, Jeri Replogle, Bruce Budowle, 1995. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis.J. Legal Med 108: 68 – 74.
16. Mark R. Wilson, Joseph A. DiZinno, Deborah Polanskey, Jeri Replogle, Bruce Budowle, 1995. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis. J Legal Med 108: 68 – 74.
17. McNevin D., Wilson - Wilde L., Robertson J., Kyd J., Lennard C., 2005. Short tandem repeat (STD) genotyping of keratinised hair. Forensic Science International 153: 237 – 259.
18. Morel G., Berger M., Ronsin B., Recher S., Richard- Blum S., Mertani H.C., Lobie P. E., 1998. In situ reverse transcription - polymerase chain reaction. Applications for light and electron microscopy. Biology of the Cell 90: 137 – 154. 19. Nozawa H.D., Yanamoto T., Uchihi R., Yoshimoto T., Tamoaki K., Hayash S.,
Ozawa T., KatsumataY., 1999. Purification of nuclear DNA from single hair shafts for DNA analysis in forensic sciences. Legal Med 1: 61 – 67.
36
20. Rees J. L., 2003. Genetics of hair and skin colour. Annu. Rev. Genet 37: 67 – 90. 21. Riginaldo Gaspar Bastos, Joreci Federizzi, Joao Carlos Deschamps, Ricardo
Cardellino and Odir Antonio Dellagostin, 2000. Characterization of swine stress gene by DNA testing using plucked hair as a source of DNA. Genetics
and Molecular Biology 23: 815 – 817.
22. Sake R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985. Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230: 1350 – 1355.
23. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Ful flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by