2.5.1. Phương pháp công nghệ
2.5.1.1. Phương pháp chuẩn bị sữa đậu tương
Đậu tƣơng nguyên hạt, khô, đƣợc lựa chọn rửa sạch và ngâm trong nƣớc ở nhiệt độ 500
C trong thời gian 4h. Sau đó, vớt đậu tƣơng ra để ráo nƣớc và xay với nƣớc theo tỉ lệ đậu: nƣớc = 1:4. Lọc hỗn hợp dịch + bã bằng vải lọc để loại bỏ bã thô. Dịch sữa đậu tƣơng thu đƣợc lần 1 (nồng độ chất khô 10o
Bx) có thể đƣợc pha loãng bằng dịch rửa bã lần 2 đến các nồng độ có nồng độ là 80
Bx, 6oBx và 4oBx theo công thức sau: V1 x N1 + V2 x N2 = V3 x N3
Trong đó:
V1: Thể tích của dịch trƣớc pha loãng
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
V2: Thể tích của dịch rửa bã
N2: Nồng độ chất khô của dịch rửa bã V3: Thể tích của dịch sau pha loãng
N3: Nồng độ chất khô của dịch sau pha loãng
2.5.1.2. Phương pháp thủy phân sữa đậu tương bằng chế phẩm enzyme thương mại
- Lựa chọn chế phẩm enzyme thích hợp cho thủy phân sữa đậu tƣơng
Sữa đậu tƣơng đƣợc thủy phân với 3 chế phẩm enzyme là Lactozym, Sumizyme FP và Novozyme 188 để lựa chọn loại chế phẩm enzyme có hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang aglucone cao nhất. Điều kiện thủy phân nhƣ sau:
Bảng 2.1. Điều kiện thủy phân sữa đậu tƣơng của các chế phẩm enzyme
Chế phẩm enzyme Điều kiện thủy phân
Nồng độ enzyme (%) Nhiệt độ (oC) pH Thời gian (h) Lactozym 2,0 38 6,5 3,0 Sumizyme FP 1,0 55 5,0 3,0 Novozyme 188 0,7 50 4,3 3,0
Các chỉ tiêu cần xác định là hàm lƣợng isoflavone (aglucone và glycoside) trong sữa đậu tƣơng sau khi thủy phân và hiệu suất chuyển hóa isoflavone của các chế phẩm enzyme.
- Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ƣu của quá trình thủy phân sữa đậu tƣơng bằng enzyme Sumizyme FP:
+ Xác định nồng độ enzyme tối ưu:
Tiến hành thí nghiệm thủy phân sữa đậu tƣơng bằng enzyme Sumizyme FP với các nồng độ enzyme là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0% tại điều kiện nhiệt độ 50o
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
thời gian 3h. Các mẫu sữa đậu tƣơng sau khi thủy phân và mẫu đối chứng (không xử lý enzyme) đƣợc xác định hàm lƣợng các isoflavone bằng phƣơng pháp HPLC.
+ Xác định giá trị pH tối ưu:
Sữa đậu tƣơng đƣợc điều chỉnh pH đạt các giá trị khác nhau là 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 và 7,0. Tiến hành thủy phân các mẫu sữa đậu tƣơng với enzyme Sumizyme FP tại điều kiện nồng độ enzyme tối ƣu, nhiệt độ 50oC trong thời gian 180 phút. Tiếp theo, phân tích hàm lƣợng các isoflavone trong sữa đậu tƣơng sau khi thủy phân để xác định giá trị pH tối ƣu.
+ Xác định nhiệt độ thủy phân tối ưu:
Nhiệt độ thủy phân sữa đậu tƣơng tối ƣu của chế phẩm enzyme Sumizyme FP đƣợc quan sát ở 7 mẫu.
Mẫu 1: Sữa đậu tƣơng + enzyme Sumizyme FP ở 300 C. Mẫu 2: Sữa đậu tƣơng + enzyme Sumizyme FP ở 350
C. Mẫu 3: Sữa đậu tƣơng + enzyme Sumizyme FP ở 400
C. Mẫu 4: Sữa đậu tƣơng + enzyme Sumizyme FP ở 450 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C. Mẫu 5: Sữa đậu tƣơng + enzyme Sumizyme FP ở 500
C. Mẫu 6: Sữa đậu tƣơng + enzyme Sumizyme FP ở 550
C. Mẫu 7: Sữa đậu tƣơng + enzyme Sumizyme FP ở 600
C.
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại nồng độ enzyme và pH tối ƣu trong thời gian 180 phút. Chỉ tiêu cần xác định là hàm lƣợng các isoflavone của sữa đậu tƣơng sau khi thủy phân.
+ Xác định thời gian thủy phân tối ưu:
Tiến hành thủy phân sữa đậu tƣơng với chế phẩm enzyme Sumizyme FP tại các điều kiện tối ƣu về nồng độ enzyme, pH và nhiệt độ trong thời gian 8h. Lấy mẫu sữa đậu tƣơng tại các thời điểm thủy phân 0, 1, 2, 4, 6 và 8h để phân tích các chỉ tiêu protein, lipid, carbohydrate và hàm lƣợng isoflavone.
- Phƣơng pháp lên men sữa đậu tƣơng:
Sữa đậu tƣơng thanh trùng đƣợc lên men với chủng vi khuẩn Bacillus trên thiết bị lên men 5 lít Labo-controller MDL-8C (Nhật Bản). Xác định ảnh hƣởng của các
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
điều kiện lên men sữa đậu tƣơng đến hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone.
+ Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:
Các mẫu sữa đậu tƣơng thanh trùng có nồng độ chất khô khác nhau là 10, 8, 6 và 4oBx đƣợc lên men với chủng vi khuẩn B.subtilis LH10 tại các điều kiện tỷ lệ cấy giống 1,5%, lắc 150 vòng/phút, tốc độ sục khí vô trùng 1,0 ml/lít/phút (v.v.m); nhiệt độ 37o
C trong thời gian 36h. Các chỉ tiêu cần xác định nhƣ sau:
- Hàm lƣợng isoflavone của các mẫu sữa đậu tƣơng trƣớc lên men
- Hàm lƣợng isoflavone, hiệu suất chuyển hóa isoflavone của các mẫu sữa đậu tƣơng sau lên men
- Số lƣợng tế bào vi khuẩn trong sữa đậu tƣơng tại thời điểm 12h lên men. + Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống:
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 sau khi nhân giống trong môi trƣờng NB đƣợc cấy vào sữa đậu tƣơng 8oBx để bắt đầu quá trình lên men theo các tỷ lệ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0%. Các điều kiện lên men là nhiệt độ 37oC, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí vô trùng 1,0 v.v.m trong thời gian 36h. Xác định hàm lƣợng isoflavone trong các mẫu sữa đậu tƣơng lên men với tỷ lệ cấy giống khác nhau.
+ Ảnh hưởng của pH dịch sữa đậu tương ban đầu:
Tiến hành lên men các dịch sữa đậu tƣơng có giá trị pH ban đầu là 6,0 (không điều chỉnh pH) và 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 (đã điều chỉnh pH) tại điều kiện nhiệt độ 37oC, tỷ lệ giống cấy 1,0%; tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí vô trùng 1,0 v.v.m trong 36h. Sau khi kết thúc quá trình lên men, xác định hàm lƣợng isoflavone của các mẫu sữa đậu tƣơng có giá trị pH ban đầu khác nhau
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men: Sữa đậu tƣơng 8o
Bx đƣợc lên men tại các nhiệt độ thay đổi từ 37o
C đến 45o C với tỷ lệ cấy giống 1,0%; pH ban đầu 6,5; tốc độ khấy 150 vòng/phút; tốc độ sục khí
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
vô trùng 1,0 v.v.m trong thời gian 36h. Các mẫu sữa đậu tƣơng đƣợc xác định hàm lƣợng isoflavone sau khi lên men tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
+ Ảnh hưởng của thời gian lên men:
Lên men sữa đậu tƣơng 8oBx với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 tại các điều kiện tối ƣu là tỷ lệ cấy giống 1,0%; pH ban đầu 6,5; tốc độ khấy 150 vòng/phút; nhiệt độ lên men 42o
C, tốc độ sục khí vô trùng 1,0 v.v.m trong thời gian 32h. Lấy mẫu tại thời điểm bắt đầu lên men (0h) và các thời điểm liên tiếp cách nhau 4h để xác định hàm lƣợng isoflavone của sữa đậu tƣơng trong suốt quá trình lên men.
+ Xác định ảnh hưởng của tốc độ sục khí vô trùng: Tiến hành lên men sữa đậu tƣơng 8o
Bx tại các điều kiện tối ƣu là tỷ lệ cấy giống 1,0%, nhiệt độ 42o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C, khuấy 150 vòng/phút, pH ban đầu 6,5 trong 28h và thay đổi thông số tốc độ sục khí vô trùng từ 0,5 đến 2,0 v.v.m. Lấy mẫu tại thời điểm bắt đầu lên men (0h) và các thời điểm liên tiếp cách nhau 4h. Các chỉ tiêu cần xác định nhƣ sau:
- Hàm lƣợng isoflavone và hiệu suất chuyển hóa isoflavone của sữa đậu tƣơng lên men tại các thời điểm khác nhau.
- Các giá trị nồng độ chất khô, pH, số lƣợng tế bào vi khuẩn và hoạt tính - glucosidase trong sữa đậu tƣơng lên men tại những thời điểm khác nhau.
2.5.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn: sử dụng phƣơng pháp đếm
khuẩn lạc trên đĩa thạch chứa môi trƣờng thạch dinh dƣỡng (NA).
2.5.3. Các phương pháp phân tích lý hóa
- Phương pháp đo pH: 30ml mẫu đƣợc lấy ra cho vào cốc mẫu. Giá trị pH đƣợc xác định trực tiếp bằng máy đo pH meter (máy đo pH 315i/ SET, Đức).
- Phương pháp xác định nồng độ chất khô: bằng khúc xạ kế Milwauke (Phần
Lan).
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
- Phương pháp xác định hàm lượng lipid: theo Shochlex 6.
- Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate:: theo Betrand 6.
- Phương pháp xác định hàm lượng isoflavone bằng sắc kí lỏng cao áp (HPLC)
- Xác định hàm lƣợng Isoflavone của đậu tƣơng bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC
Thiết bị: Hệ thống sắc ký đƣợc sử dụng bao gồm : -Bơm dung môi 2690 có bộ phận bơm mẫu tự động.
-Detector PDA 2996, ở bƣớc sóng 260 nm, chế độ Gradient -Phần mềm Empower.
-Cột sắc ký:Luna (2)C18(250mm x 3,9 mm, 5m, Phenomenex, Mỹ). -Pha động A: Axit acetic 0,1 %
-Pha động B: Acetonitril 80% trong axít acetic 0,1%
-Dung dịch chuẩn với nồng độ 0,1- 25 g/ml đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan các chất trong methanol và đƣờng chuẩn thu đƣợc từ diện tích pick. Các chất chuẩn dùng để phân tích isoflavone bao gồm 12 dạng, 4 dạng của daidzein, 4 dạng của genistein và 4 dạng của glycitein.
-Chƣơng trình dung môi pha động phân tích isoflavone:
Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/ phút) Tỷ lệ A (%) Tỷ lệ B (%) 0 1,0 88 12 5 1,0 88 12 9 1,0 78 22 20 1,0 70 30 30 1,0 70 30 35 1,0 60 40
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
45 1,0 88 12
Quy trình thực hiện:
Cân 0,5 g mẫu bột (hoặc 2,0g mẫu lỏng) vào ống ly tâm có nắp xoáy 50ml
Thêm 10 ml acetonitril, 2 ml HCl 0,1M và 4 ml nƣớc cất (2ml đối với mẫu lỏng)
Khuấy đều, lắc qua đêm ở nhiệt độ phòng bằng máylắc ngang
Chuyển vào ống ly tâm, ly tâm 3000 vòng/ phút
Chuyển dịch chiết vào một ống ly tâm thứ 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hút 2ml dịch chiết, thổi khô dịch chiết bằng khí nitơ
Hòa tan lại bằng 2ml methanol
Lọc qua màng PTFE 0,45 m
Bơm vào sắc ký lỏng
- Phương pháp xác định hoạt tính enzyme - glucosidase:
Nguyên tắc:
Hoạt tính β-glucosidase xác định bằng phƣơng pháp đo mức độ thủy phân của cơ chất ρ – NPG. Một đơn vị hoạt tính của enzyme đƣợc định nghĩa là hàm lƣợng β- glucosidase làm giải phóng 1µM ρ – nitrophenol từ cơ chất ρ – NPG trong 1 phút dƣới các điều kiện tiêu chuẩn.
Tiến hành phản ứng:
Lấy 1 ml mẫu ly tâm với vận tốc 15.000 vòng trong 5 phút. Sau đó, dịch nổi đƣợc loại bỏ và thu sinh khối tế bào. Rửa tế bào với đệm sodium phosphate (pH=7).
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Tế bào đƣợc hòa trong 0,5ml đệm sodium phosphate (pH=7) chứa 5mM cơ chất ρ – NPG và ủ tại 370
C trong 20 phút. Phản ứng đƣợc dừng lại bằng cách thêm 0,5ml Na2CO3 2M và ly tâm hỗn hợp với vận tốc 15.000 vòng trong 5 phút. Thu dịch nổi và đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng λ=405nm. Đơn vị của hoạt tính enzyme là U/ml trong đó một đơn vị enzyme (U) đƣợc định nghĩa là hàm lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1 µmol p-nitrophenol/phút.
Xây dựng đường cong chuẩn: Đƣờng cong chuẩn đƣợc chuẩn bị bằng cách đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng λ405 của dung dịch ρ-nitrophenol tại các nồng độ khác nhau (20- 160µM).
Tính toán: Hàm lƣợng ρ-nitrophenol tạo ra trong phản ứng đƣợc tính toán bằng phép nội suy theo đƣờng cong chuẩn.
- Xác định hiệu suất chuyển hóa isoflavone (Chien và cộng sự, 2006)
Trong đó: H: Hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glucoside sang aglucone (%) m1: Hàm lƣợng isoflavone glucoside trƣớc khi lên men (mg/100g)
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone trong đậu tƣơng từ dạng glycoside sang dạng aglucone bằng chế phẩm enzyme
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm enzyme thích hợp
Các isoflavone dạng aglucone có hoạt tính sinh học cao nhƣng lại chiếm hàm lƣợng rất thấp trong đậu tƣơng (1-5% hàm lƣợng isoflavone tổng số). Do vậy, nhiều nghiên cứu gần đây đã tập trung sự quan tâm vào việc thu nhận chế phẩm isoflavone có nồng độ aglucone cao. Do các isoflavone dạng glycoside có thể chuyển hóa thành dạng aglucone nhờ hoạt tính enzyme -glucosidase nên trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ba chế phẩm enzyme rất phổ biến trong công nghiệp thực phẩm là enzyme Novozyme 188 có hoạt tính -glucosidase , enzyme Sumizyme FP có hoạt tính - glucosidase và protease, enzyme Lactozym có hoạt tính -galactosidase để nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone trong dịch sữa đậu tƣơng.
Trong thí nghiệm này, các mẫu sữa đậu tƣơng có nồng độ chất khô 8o
Bx đƣợc thủy phân bởi 3 enzyme với các điều kiện nồng độ, nhiệt độ căn cứ theo khuyến cáo của nhà sản xuất (mục 2.5.1.2 của phần Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu) để so sánh hiệu suất chuyển hóa isoflavone giữa các chế phẩm enzyme. Hàm lƣợng isoflavone và hiệu suất chuyển hóa isoflavone sau khi xử lý enzyme đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lƣợng isoflavone trong sữa đậu tƣơng thủy phân với các chế phẩm enzyme khác nhau Hàm lƣợng isoflavone Đối chứng* Chế phẩm enzyme Sumizyme FP 1,0% Novozyme 188 0,7% Lactozym 2,0% Aglucone 1,56 15,47 12,68 12,11
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
glycoside 23,64 5,08 8,07 8,94
Isoflavone tổng số 25,20 20,55 20,75 21,05
* Mẫu sữa đậu tương không thủy phân với enzyme
Hình 3.1. Hiệu suất chuyển hóa isoflavone trong sữa đậu tƣơng thủy phân bằng các chế phẩm enzyme khác nhau
Kết quả bảng 3.1 cho thấy hàm lƣợng isoflavone tổng số trong mỗi mẫu dịch sữa đậu tƣơng thủy phân bằng chế phẩm enzyme không khác nhau nhiều. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone thay đổi giữa các mẫu xử lý enzyme khác nhau (Hình 3.1). Cụ thể, chế phẩm enzyme Sumizyme FP có khả năng chuyển hoá isoflavone cao nhất là 78,51%. Hai chế phẩm Novozyme 188 và Lactozyme chỉ chuyển hoá đƣợc 65,86% và 62,18% tƣơng ứng. Điều này có thể giải thích là do chế phẩm Sumizyme FP ngoài hoạt tính -glucosidase là chủ yếu còn có hoạt tính protease. Theo Wang và Murphy (1996), các phân tử isoflavone có xu hƣớng liên kết với các thành phần hòa tan của đậu tƣơng, chủ yếu là các protein 68. Trong dịch sữa đậu tƣơng, hàm lƣợng protein khá cao, nên sự tác động của enzyme protease phân cắt protein làm giải phóng các phân tử isoflavone tự do. Từ đó, các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
40 50 60 70 80 90 100 H iệ u su ất c hu yể n hó a is of la vo n (%)
Sumizyme FP Novozyme 188 Lactozym
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
enzyme -glucosidase dễ dàng tiếp xúc đƣợc với cơ chất isoflavone để xúc tác cho phản ứng xảy ra. Kết quả là sự thuỷ phân các glycoside của enzyme -glucosidase đƣợc diễn ra nhanh và triệt để hơn. Do vậy, chúng tôi lựa chọn enzyme Sumizyme FP để nâng cao hàm lƣợng aglucone của sữa đậu tƣơng trong những nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu của enzyme Sumizyme FP thủy phân sữa đậu tương
3.1.2.1. Xác định nồng độ tối ưu của enzyme Sumizyme FP
Mỗi loại enzyme có các điều kiện hoạt động tối ƣu riêng cho từng cơ chất. Trong đó, nồng độ enzyme sử dụng có ý nghĩa quan trọng đối với hiệu suất phản ứng bởi vì nếu sử dụng thiếu thì hiệu suất phản ứng thấp do không đủ enzyme xúc tác cho các phản ứng xảy ra. Tuy nhiên, sử dụng dƣ thừa enzyme cũng gây ức chế phản ứng do sự cạnh tranh cơ chất giữa các phân tử enzyme đồng thời gây lãng phí về kinh tế. Do vậy, cần thiết phải xác định nồng độ chế phẩm enzyme thích hợp đối với sữa đậu tƣơng để vừa đạt đƣợc hiệu suất chuyển hoá isoflavone cao nhất vừa đảm bảo tiết kiệm chi phí. Trong thí nghiệm này, các nồng độ enzyme Sumizyme FP khác nhau đƣợc sử