Enzyme – glucosidase
Enzyme –glucosidase hay còn gọi là –D–glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21) hoạt động trên các liên kết - 1 – 4 glucoside của cellobiose là cellodextrin cũng nhƣ các olygomer của glucose. Chúng xúc tác cho phản ứng thủy phân các gốc – D – glucoside tận cùng ở đầu không khử để giải phóng ra các phân tử glucose.
Hình 1.7. Cấu trúc enzyme – glucosidase A từ vi khuẩn Clostridium cellulovorans
Các enzyme -glucosidase đƣợc phân bố rộng rãi trong thực vật, nấm sợi, động vật có vú, vi sinh vật và thực hiện nhiều chức năng khác nhau. Chúng tham gia xúc tác cho quá trình trao đổi chất của glycolipid và glycoside ngoại bào ở động vật, cơ chế tự bảo vệ, sự hóa gỗ thành tế bào, hoạt hóa các phytohormone và giải phóng các hợp chất thơm ở thực vật cũng nhƣ chuyển hóa sinh khối ở vi sinh vật. Những chức năng này dẫn tới nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp. Các β-glucosidase đã đƣợc phân loại vào các họ hydrolase glycoside (GH) là GH1, GH3, GH5, GH9, và GH30 dựa trên các trình tự axit amin của chúng, trong khi các β-glucosidases còn lại vẫn tiếp tục đƣợc phân loại. Các β-glucosidase họ GH1, GH5, và GH30 thuộc nhóm GH Clan A, trong đó bao gồm các protein với cấu trúc lõi (β /α)8. Ngƣợc lại, vị trí hoạt động của enzyme GH3 bao gồm hai domain, trong khi họ GH9 có cấu trúc lõi (α/α)6 (James và cộng sự, 2010).
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Trong phản ứng thủy phân các isoflavone đậu tƣơng, enzyme -glucosidase sẽ xúc tác cho phản ứng bẻ gẫy liên kết -1–4 glucoside của các glycoside để giải phóng ra các phân tử glucose tự do và aglucone tƣơng ứng (hình 1.8). Nguồn enzyme - glucosidase để thủy phân các isoflavone glycoside có thể từ quá trình nảy mầm đậu tƣơng (các enzym nội sinh của đậu tƣơng), các chế phẩm enzyme thƣơng mại hoặc từ các vi sinh vật lên men.
Hình 1.8. Sự thủy phân các isoflavone bằng enzyme -glucosidase
Ribeiro và cộng sự (2007) đã nghiên cứu hoạt động của enzyme -glucosidase và hàm lƣợng isoflavone trong quá trình nảy mầm của đậu tƣơng. Các tác giả nhận thấy rằng đậu tƣơng đƣợc nảy mầm 72h ở nhiệt độ 35oC có hoạt độ -glucosidase tăng lệ 3,3 lần ở rễ và 2,3 lần ở mầm. Trong phần rễ, hàm lƣợng isoflavone tổng số giảm đi đáng kể (6,3 lần) trong khi isoflavone dạng malonyl là malonyl daidzin và malonyl glycitin giảm từ 5 đến 10 lần. Trong phần lá mầm, hàm lƣợng isoflavone tổng số tăng lên 2,4 lần. Quá trình nảy mầm đƣợc kiểm soát có thể làm tăng hàm lƣợng isoflavone trong hạt 62.
Một số chế phẩm enzyme thƣơng mại có hoạt tính – glucosidase đã đƣợc sử dụng để làm giàu isoflavone dạng aglucone trong đậu tƣơng nhƣ Molsin F (Kikkoman Corp.), Sumizyme FP (Shin-nihon Kagaku Kogyo K.K.), ... Theo patent số US 2001/0010930 A1 của Mỹ, Obata và cộng sự (2001) đã làm giàu hàm lƣợng isoflavone
Glucose/
Malonyl glucose
-glucosidase đặc hiệu với các liên kết isoflavone H2O
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
aglucone trong bột đậu tƣơng tách béo bằng enzyme Sumizyme FP. Kết quả thu đƣợc là hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang aglucone của quá trình thủy phân đạt trên 90% 49.
Ngoài enzyme -glucosidase thì -galactosidase cũng thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Bởi vì, enzyme này không chỉ cắt chính xác liên kết -galactoside mà còn có thể thủy phân liên kết α-galactoside trong α-lactose. Do vậy, - galactosidase đƣợc cho rằng có thể chịu trách nhiệm cho quá trình chuyển hóa glucoside sang aglycone bởi vì liên kết -galactoside và -glucoside tƣơng đối giống nhau. Theo kết quả nghiên cứu của Pham T. T. (2009), - galactosidase đƣợc chứng minh có khả năng thủy phân các isoflavone dạng glycoside trong sữa đậu tƣơng tạo thành các aglycone tƣơng ứng, thậm chí ở nồng độ thấp 0,5U/ml 53. Mặc dù, so sánh với enzyme -glucosidase thì - galactosidase có hiệu quả xúc tác yếu hơn nhƣng kết quả này đã mở ra một phƣơng pháp mới để sản xuất aglycone bởi vì enzyme này rất phong phú trong tự nhiên và đã đƣợc sử dụng rộng rãi ở dạng chế phẩm enzym thƣơng mại trong công nghiệp thực phẩm. Theo patent số 5,352,384 của Mỹ, Shen và cộng sự (1994) đã sử dụng enzyme Lactozym có hoạt tính -galactosidase của công ty Novozymes, Đan Mạch để thủy phân bột đậu tƣơng tách béo. Kết quả thu đƣợc sản phẩm protein giàu isoflavone dạng aglucone 58.
Nguồn enzyme – glucosidase từ các vi sinh vật lên men đậu tƣơng
Trong những năm gần đây, một số nhà nghiên cứu đã báo cáo về quá trình chuyển hóa isoflavone từ glycoside thành aglucone nhờ quá trình lên men của vi sinh vật. Ứng dụng các phƣơng pháp chế biến thực phẩm truyền thống, sự chuyển hóa isoflavone đậu tƣơng từ glycoside sang aglucone đã đƣợc quan sát thấy trong suốt quá trình lên men với một số vi sinh vật nhƣ Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus subtilis,… 51, 65, 15, 70, 71. Mục đích của quá trình lên men đậu tƣơng với các chủng vi sinh vật là để tạo ra enzyme -glucosidase nội bào có khả năng thủy phân các glycoside chiếm ƣu thế trong đậu tƣơng và sữa đậu tƣơng thành dạng aglucone có hoạt tinh sinh học cao. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu lên men đậu tƣơng với các chủng
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
vi khuẩn probiotic. Những nghiên cứu này chỉ ra rằng các enzyme nội bào – glucosidase từ vi khuẩn probiotic có thể sử dụng để thủy phân glycoside trong sữa đậu tƣơng thành aglucone. Chien và cộng sự (2006) đã nghiên cứu sự thủy phân của các isoflavone dạng glycoside bởi vi khuẩn lactic và nhận thấy 70 – 80% genistin đƣợc chuyển thành genistein đồng thời 25 -40% daidzin chuyển thành daidzein sau quá trình lên men 15.
Bảng 1.7. Các vi sinh vật đƣợc sử dụng để chuyển hóa isoflavone đậu tƣơng từ glycoside sang aglucone
Vi sinh vật Sản phẩm Tài liệu trích dẫn
Bacillus subtilis Bacillus lichenformis B.amyloliquefaciens Actinomucor elegans Rhizopus olglycosidosporus Aspergillus oryaze Weissella confusa Enterococcus durans Streptococcus infantarius L. acidophilus B. animalis L. casei
L. delbrueckii subsp. blugaricus B. longum
S.thermophilus
Natto Thua nao Chungkookjang Sữa đậu tƣơng đen lên men
Chungkookjang Chungkookjang
Sufu Tempeh
Miso
Sữa đậu tƣơng lên men Sữa đậu tƣơng lên men Sữa đậu tƣơng lên men Sữa đậu tƣơng lên men Sữa đậu tƣơng lên men Sữa đậu tƣơng lên men Sữa đậu tƣơng lên men Sữa đậu tƣơng lên men Sữa đậu tƣơng lên men
29, 71, 31 31 38 36 36 76 43 75 18, 19 18 19 15, 51, 21 65, 51, 21 17, 51, 21 17, 56 15, 65, 70 15, 56
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
1.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.4.1. Nguồn gốc và phân loại
Bacillus subtilis đƣợc phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872. Vi khuẩn
Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đƣờng ruột. Chúng đƣợc phân bố hầu hết trong tự nhiên nhƣ: cỏ khô, bụi, đất, nƣớc, nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ khô.
Hình 1.9. Hình ảnh hiển vi điện tử của Bacillus subtilis
Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc giới: Prokaryota, ngành: Protophyta, lớp: Schyzomycetales, bộ: Eubacteriales, họ: Bacillaceaeu, giống: Bacillus, loài: Bacillus subtilis.
1.4.2. Đặc điểm hình thái
- Hình thái tế bào: Là những vi khuẩn Gram dƣơng có hình que, ngắn, nhỏ, kích thƣớc (3-5) × 0,6µm, các tế bào có thể đứng riêng rẽ hoặc nối với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau.
- Hình thái khuẩn lạc: khuẩn lạc to, màu trắng đục, bám vào mặt thạch, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn, nhớt.
- Vi khuẩn có khả năng tạo bào tử hình bầu dục, kích thƣớc 0,6-0,9µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhƣng không chính tâm.
1.4.3. Đặc điểm nuôi cấy
- Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trƣởng là 30-50o
C, thƣờng nuôi cấy ở 37o
C. Vi khuẩn Bacillus subtilis có màng nhày (giáp mạc) giúp vi khuẩn có khả năng chịu đựng đƣợc điều kiện thời tiết khắc nghiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thƣơng khi khô hạn.
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
- Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là một vi khuẩn hiếu khí nhƣng vẫn có khả năng phát triển trong môi trƣờng thiếu oxy.
- Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp với pH = 7,0-7,4.
- Dinh dƣỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác
1.4.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong lên men đậu tương
Vi khuẩn Bacillus subtilis tham gia vào quá trình lên men của nhiều sản phẩm đậu tƣơng truyền thống của Châu Á nhƣ natto, douchi, chungkookjang, thua nao… Nhờ khả năng sinh ra enzyme β-glucosidase xúc tác cho phản ứng thủy phân isoflavone từ dạng glucoside sang dạng aglucone nên hàm lƣợng các aglucone trong các sản phẩm đậu tƣơng lên men này có giá trị cao hơn so với các sản phẩm đậu tƣơng không lên men 67. Trong pha đầu tiên (pha lag) và pha sinh trƣởng mũ (pha log), vi khuẩn tiết rất ít enzyme ngoại bào. Sự tiết enzyme chỉ đạt cực đại vào cuối pha log hoặc đầu pha cân bằng ví dụ nhƣ sự thủy phân các isoflavone dạng glucoside nhờ - glucosidase chỉ đƣợc nhận thấy sau 8h cấy chủng giống Bacillussubtilis 36.
Theo kết quả nghiên cứu của Katedan (2009) hàm lƣợng isoflavone tổng số trong các sản phẩm đậu tƣơng lên men với chủng Bacillus subtilis BEST 195,
B.subtilis Asaichiban và B.subtilis TN51 tăng mạnh từ 43-99% so với đậu tƣơng không lên men. Đặc biệt, sản phẩm đậu tƣơng lên men với Bacillus subtilis Asaichiban theo kiểu natto có hàm lƣợng isoflavone tổng số và aglucon tăng lên đáng kể sau 24h ở nhiệt độ 42oC. Cụ thể, hàm lƣợng isoflavone tổng số tăng từ 328 lên 864µg/g và aglucone tăng từ 73 lên 201µg/g 31.
Năm 2006, Kuo và cộng sự đã quan sát thấy sự chuyển hóa các isoflavone từ glucoside sang aglucone bởi vi khuẩn Bacillus subtilis NTU-18 trong quá trình lên men đậu tƣơng đen. Hiệu suất chuyển hóa của daidzin và genistin tại thời điểm 24h lên men tƣơng ứng đạt 100% và 75% 36.
Hiệu suất chuyển hóa isoflavone của mỗi chủng Bacillus subtilis là khác nhau. Năm 2008, Wei và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng 4 chủng Bacillus subtilis để lên men đậu tƣơng theo kiểu natto. Phân tích thành phần và hàm lƣợng các isoflavone trong sản phẩm lên men cho thấy chủng Bacillus subtilis BCRC 14718 lên men ở nhiệt
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
độ 37o
C trong 48h có khả năng chuyển hóa isoflavone cao nhất với tỷ lệ aglucone chiếm đến 68% so với mẫu đối chứng (natto thƣơng mại) là 12%. Trong đó, hàm lƣợng daidzein tăng từ 6 lên 54% và genistein tăng từ 5 lên 13% [71]. Ngoài ra, Lim và cộng sự (2009) cũng đã nghiên cứu sự chuyển hóa của các isoflavone bởi các loài
Bacillus subtilis phân lập từ sản phẩm chungkookjang truyền thống. Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình trao đổi chất của các isoflavone đậu tƣơng phụ thuộc rất lớn vào chủng Bacillus subtilis sử dụng (bảng 1.8). Do vậy, việc lựa chọn chủng vi sinh vật lên men đậu tƣơng là rất cần thiết.
Bảng 1.8. Hàm lƣợng isoflavone trong chungkookjang lên men với các chủng
Bacillus subtilis khác nhau 38
khô Isoflavon (µg/g trọng lƣợng)
Đậu tƣơng không lên men
Chungkookjang B.subtilis 3-5 B.subtilis 3-25 B.subtilis 97 Daidzin Glycitin Genistin Malonyl-Daidzin Malonyl-Glycitin + IM Malonyl-Genistin Axetyl-Daidzin Axetyl-Glycitin Axetyl-Genistin Glycoside tổng số Daidzein Glycitein + GM Genistein Aglucone tổng số Isoflavone tổng số 481 177 948 272 74 299 130 77 148 2607 36 11 37 83 2690 316 143 445 171 9 345 271 53 25 1779 172 254 325 751 2530 268 108 468 219 105 351 32 53 11 1615 192 110 342 644 2259 611 150 681 92 144 211 3 82 20 1995 158 135 264 577 2551
Ghi chú: IM: các chất chuyển hóa của isoflavone, GM: các chất chuyển hóa của
genistein
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng đậu tƣơng tốt cho sức khỏe con ngƣời nhờ có chứa thành phần isoflavone. Một số hoạt tính sinh lý của isoflavone liên quan đến sự điều chỉnh hormone nhƣ cải thiện các hội chứng tiền mãn kinh 37 và tăng mật độ xƣơng ở phụ nữ mãn kinh 42, ngăn ngừa bệnh tim mạch và ung thƣ đã thu hút sự quan tâm của ngƣời tiêu dùng đối với các sản phẩm thực phẩm giàu isoflavone từ đậu tƣơng. Hiện nay, bên cạnh các thực phẩm giàu isoflavone đƣợc chế biến trực tiếp từ đậu tƣơng nhƣ sữa đậu tƣơng, phô mai đậu tƣơng, natto, tempeh thì ngày càng xuất hiện nhiều các sản phẩm đƣợc bổ sung chế phẩm isoflavone nhƣ bột ngũ cốc, sữa bột, nƣớc giải khát… Một số loại thực phẩm giàu isoflavone đậu tƣơng đƣợc liệt kê trong bảng dƣới đây cùng với hàm lƣợng isoflavone của chúng.
Bảng 1.9. Một số thực phẩm giàu isoflavone
Sản phẩm Hàm lƣợng isoflavone trung bình (mg/100g) Isoflavone
Tổng số
Daidzein Genistein Glycitein
Natto 82,29 33,22 37,66 10,55
Súp Miso 1,52 0,78 0,73 0,03
Tempeh 60,61 22,66 36,15 3,82
Nƣớc uống protein đậu tƣơng
81,65 27,98 42,91 10,76
Chất xơ đậu tƣơng 44,43 18,80 21,68 7,9
Sữa bột đậu nành trẻ em Mead Johnson Prosobee
25,09 8,08 13,90 3,12 Sữa bột đậu nành trẻ em Wyeth-Ayerst Nursoy 4,02 1,02 2,82 0,35 Sữa bột đậu nành trẻ em Ross Isomil 20,99 6,03 12,23 2,73
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Mặc dù các sản phẩm chế biến từ đậu tƣơng luôn đƣợc khuyến khích sử dụng vì chúng không chỉ giàu isoflavone mà còn rất giàu protein, axít amin tự do và các axít béo không no tốt cho sức khỏe con ngƣời. Nhƣng mùi vị đậu tƣơng và các sản phẩm đậu tƣơng lên men thƣờng khó chấp nhận đối với những ngƣời không sử dụng thƣờng xuyên, thậm trí một số trƣờng hợp còn gặp tác dụng phụ nhƣ đầy hơi, trƣớng bụng. Do vậy, các nhà sản xuất đang phát triển các loại sản phẩm thực phẩm bổ sung isoflavone dƣới dạng viên (viên nang, viên nén) để thuận tiện cho ngƣời tiêu dùng với một hƣơng vị dễ chịu và cho phép một liều lƣợng hấp thụ chính xác của isoflavone. Theo hƣớng dẫn sử dụng của nhà sản xuất, chúng ta có thể hấp thụ khoảng 40 – 50 mg isoflavone mỗi ngày. Hàm lƣợng này cũng tƣơng đƣơng với hàm lƣợng isoflavone hấp thụ trung bình qua thực phẩm đậu tƣơng của ngƣời Trung Quốc và Nhật Bản. Hiện nay, một số thực phẩm bổ sung isoflavone đƣợc chào bán rộng rãi trên thị trƣờng nhƣ Soy Isoflavone Concentrate (hãng sản xuất: GNC Natural Brand, Hoa kỳ) có hàm lƣợng 20mg isoflavone/viên nang, Soy Isoflavones Extract (Hãng sản xuất: Trophic, Canada) với hàm lƣợng 50mg isoflavone/viên nang, Soy Isoflavones (Natrol, Hoa Kỳ) với hàm lƣợng 10 mg isoflavone/viên nang, …
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu
- Đậu tƣơng giống ĐT84 do Viện Khoa học Nông nghiệp cung cấp. - Ba chế phẩm enzyme thƣơng mại gồm:
+ Enzyme Lactozym có hoạt tính -galactosidase (3000 U/ml) đƣợc cung cấp bởi công ty Novo Nordisk (Đan Mạch),
+ Enzyme Novozyme 188 có hoạt tính -glucosidase (250U/g) của công ty Novozymes (Đan Mạch).
+ Enzyme Sumizyme FP có các hoạt tính -glucosidase (172U/g) và protease (50,000U/g) của công ty Shin-nihon Kagaku (Nhật Bản).
2.2. Vi sinh vật và môi trƣờng của vi sinh vật
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 phân lập từ sản phẩm natto vùng Nagoya (Nhật Bản).
Hình 2.1. Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10
- Môi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào: Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng NA (Nutrient Agar): Cao thịt: 3g/l; Pepton: 5g/l; Thạch: 20g/l. Khử trùng môi trƣờng ở nhiệt độ 1210
C trong thời gian 30 phút.
- Môi trường nhân giống: Môi trƣờng dinh dƣỡng NB (Nutrient Broth): cao thịt: 3g/l; Pepton: 5g/l. Khử trùng môi trƣờng ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 30 phút.
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
- Môi trường lên men: Dịch sữa đậu tƣơng đƣợc khử trùng ở nhiệt độ 1210
C trong thời gian 30 phút.
2.3. Hóa chất
Các hóa chất phân tích sử dụng của Merck (Đức), Sigma (Mỹ), BDH (Anh) và A.R (Trung Quốc).
2.4. Dụng cụ máy móc, thiết bị
Sử dụng các dụng cụ, máy móc và thiết bị có tại phòng thí nghiệm Bộ môn Thực phẩm và dinh dƣỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm và Viện Dinh dƣỡng gồm một số thiết bị chính sau:
- Máy lắc SI600 (Hàn Quốc)