PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mô

Xử lý mẫu: Một cặp mẫu mô đại trực tràng của cùng một bệnh nhân (mẫu mô u và mẫu mô lân cận u) đƣợc lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali phosphate 100mM, pH 8,0. Sau khi rửa, hai mẫu mô đƣợc cân với lƣợng tƣơng đƣơng 0,03 – 0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt.

Tiến hành: tách chiết DNA tổng số sử dụng kit tách chiết DNA từ mô QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trính của nhà sản xuất.

 Bổ sung vào mỗi ống epp: buffer ATL và proteinase K, vortex và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô đƣợc thủy phân hoàn toàn. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dình trên nắp.

 Thêm buffer AL, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dình trên nắp.

 Thêm ethanol (96 – 100%), vortex trong 15s. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dình trên nắp.

 Cho toàn bộ dung dịch thu đƣợc lên cột QIAamp Spin Column. Ly tâm ở 6000 g (8000 rpm) trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch.

 Bổ sung lên cột buffer AW1. Ly tâm ở 6000g (8000 rpm) trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch.

 Bổ sung lên cột buffer AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 20.000g (14.000 rpm) trong 3 phút. Có thể lặp lại bƣớc này.

 Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch.Thêm buffer AE hoặc nƣớc sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 6000g (8000 rpm) trong 1 phút. Lặp lại bƣớc trên 2 lần.

 Làm khô di ̣ch thu đƣợc bằng máy Speed vac trong 2h.

 Hòa tan DNA trong buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho các thì nghiệm tiếp theo.

 Kiểm tra quá trính tách chiết DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8 –1%. 2.2.2. Khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng PCR

Kỹ thuật PCR là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn DNA lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012 – 10¹³ bản sao).

Thiết kế 4 cặp mồi: mtDNA, 49771, 49772 và ND3. Các că ̣p mồi đƣợc thiết kế đ ặc hiệu sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer Premier 5 với trính tự mtDNA đƣợc tham khảo từ cơ sở dữ liệu trong NCBI. Bên cạnh đó, để khẳng định tình đặc hiệu của cặp mồi sau khi đƣợc thiết kế, chúng tôi có sử dụng thêm 2 chƣơng trính kiểm tra: Primer QuestSM

[48] và Primer Blast [49,50]. Trính tự các că ̣p mồi đƣợc trình bày ở Bảng 7.

Bảng 7: Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR

Tên mồi Trình tự mồi ^{Kích thƣớc sản}

phẩm (bp)

mtDNA

f 5’ GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC  3’

433 r 5’ GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG  3’

49771

f 5’ TCA ATG CTC TGA AAT CTG TGG  3’

496 r 5’ GTT GAC CTG GGG TGA GAA G  3’

49772 ^{f 5’ ACA GTT TCA TGC CCA TCG TC  3’} 381 r 5’ GCG TTT GTG TAT GAT TTT GC  3’

ND3

f 5’ CCT GCC ACT AAT AGT TAT GTC  3’

246 r 5’ GAT ATG AGG TGT GAG CGA TA  3’

4 cặp mồi được sử dụng:

 Cặp mồi mtDNA đƣợc thiết kế để nhân đoạn trính tự nằm ngoài vùng mất đoa ̣n 4977 bp của hệ gen ty thể qua đó kiểm tra sự có mặt của mtDNA trong dịch DNA tổng số tách chiết từ mô

 2 cặp mồi: 4977–1 và 4977–2 đƣợc thiết kế để nhân đoạn mtDNA mang đột biến mất đoạn 4977 bp. Nếu không có hiện tƣợng mất đoạn 4977 bp xẩy ra thí phản ứng PCR với 2 cặp mồi này sẽ không thể xẩy ra ví sản phẩm có kìch thƣơc quá lớn. Tuy nhiên nếu hiện tƣợng mất đoạn 4977 bp xẩy ra thí theo lý thuyết phản ứng PCR sẽ thu đƣợc sản phẩm. Quá trính PCR đƣợc mô tả nhƣ sau: Đầu tiên, PCR với cặp mồi 4977–1 (1R, 1F) nhƣ trong Hình 8 sản phẩm thu đƣợc tƣơng ứng sẽ là đoạn DNA có kìch thƣớc 496 bp. Tiếp đó thực hiện phản ứng PCR thứ 2 với cặp mồi 4977–2 (2R, 2F) nhƣ trong Hình 8, Sử

dụng khuôn là sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất mồi 4977-1 và sản phẩm thu đƣợc là đoạn DNA có kìch thƣớc 381 bp.

 Cặp mồi ND3: Cặp mồi này sẽ nhân đoạn gen có kìch thƣớc 246 bp nằm trong vùng xẩy ra đột biến mất đoạn 4977 bp của mtDNA. Nếu đột biến mất đoạn 4977 bp xẩy ra thí phản ứng PCR này sẽ không thể thực hiện, nếu đột biến mất đoạn 4977 bp không xẩy ra thí phẩn ứng PCR sẽ đƣợc thực hiện và khuếch đại đoạn trính tự 246bp.

Hình 8: Minh họa sự bắt cặp của hai cặp mồi 49771 và 49772 trên khuôn của mtDNA bị đột biến mất đoạn 4977 bp [33]

Thành phần phản ứng PCR: thành phần của phản ứng nhƣ trong Bảng 8. Bảng 8: Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l Thành phần ^{Thể tích} (l) Nồng độ cuối cùng Master Mix 2x 6,25 1X Primer F 0,25 0,2 M Primer R 0,25 0,2 M DNA khuôn 2 Nƣớc 3,75 Tổng thể tìch phản ứng 12,5

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

 Chu trính nhiệt đối với cặp mồi mtDNA, 4977–1 và ND3 nhƣ sau:

Tiến hành phản ứng PCR:

 Bƣớc 1: DNA tổng số đƣợc lấy làm khuôn, cùng các thành phần phản ứng nhƣ đã nêu ở trên. Tiến hành phản ứng PCR

 Bƣớc 2: Sản phẩm PCR đƣợc lấy điện di kiểm tra agarose hoặc polyacrylamide

 Bƣớc 3: Bản gel điện di đƣợc nhuộm và phát hiện băng.

2.2.3. Xử lý sản phẩm PCR khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng enzyme HaeIII

Enzym HaeIII là enzyme endonuclease nhận biết DNA vớ i trính tự:

Để kiểm tra tình chình xác của sản phẩm PCR của cặp mồi 4977–2 kìch thƣớc 381bp. Sản phẩm PCR đƣợc xử lý với enzyme giới hạn HaeIII. Trong trƣờng hợp sản phẩm PCR thu đƣợc là chình xác sẽ chứa 2 vị trì nhận biết của HaeIII. Khi cắt sẽ tạo thành 3 đoạn có kìch thƣớc 141 bp, 183 bp và 57 bp (Hình 9).

Hình 9: Minh họa sự cắt của enzyme HaeIII

5’ ... G G C C ... 3’ 3’ ... C C G G ... 5’

Thành phần phản ứng cătbằng enzyme HaeIII : trong Bảng 9. Bảng 9: Thành phần phản ứng ủ enzyme với thể tích 30 µl Thành phần Thể tích (µl) 10X FastDigest® buffer 2 Sản phẩm PCR (~ 0,2 µg) 10 FastDigest® enzyme 1 Nƣớc siêu sạch khử trùng 17

Hỗn hợp đƣợc trộn đều, ly tâm nhẹ, ủ 7 – 10 phút trong bể ổn nhiệt ở 37⁰C. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc để quan sát kết quả.

2.2.4. Quy trính tinh sạch sản phẩm PCR sƣ̉ du ̣ng kit QIAQUICK gel extraction Kit này đƣợc dùng để tinh sạch DNA có kìch thƣớc từ 70bp đến 10kb từ Kit này đƣợc dùng để tinh sạch DNA có kìch thƣớc từ 70bp đến 10kb từ gel agarose dạng chuẩn hoặc dạng low-melt trong đệm TBE hoặc TAE. Với lƣợng agarose < 400mg có thể đƣợc tiến hành trên một cột.

Các bước tiến hành:

1. Cắt các mảnh gel agarose chứa DNA bằng con dao mảnh, sắc.

2. Đựng và cân mảnh gel vào trong ống không màu. Bổ sung 3 thể tìch đệm QG cho một thể tìch gel. Với agarose>2% thí bổ sung 6 thể tìch đệm QG.

3. Ủ ở 50 °C trong 10 phút. Để giúp hòa tan gel thí cứ 2-3 phút lại vortex mỗi ống trong thời gian ủ.

4. Sau khi gel đã hòa tan hoàn toàn, kiểm tra nếu màu sắc của hỗn hợp có màu vàng là đƣợc (tƣơng tự nhƣ đệm QG khi chƣa hòa tan gel agarose).

5. Thêm một thể tìch isopropanol vào mẫu và Mix.

6. Đặt cột QIAquick spin vào ống 2ml collection (thuộc kit).

7. Gắn DNA lên màng. Cho mẫu vào cột và ly tâm trong 1 phút. Thể tìch lớn nhất của cột là 800 μl. Nếu >800 μl thí đổ lại dịch lên cột và ly tâm lại.

8. Đổ bỏ phần dịch chạy qua cột và đặt lại cột vào ống cũ.

9. Thêm 0,5 ml đệm QG vào cột và ly tâm 1 phút. Giúp loại bỏ tất cả agarose. 10.Rửa cột: bổ sung 0.75 ml đệm PE vào cột và ly tâm 1 phút.

11.Bỏ phần dịch qua cột và ly tâm cột thêm 1 phút ở 17.900g (13.000 rpm). 12.Đặt cột vào trong ống 1,5 ml sạch.

13.Thôi DNA: Thêm 50 μl đệm EB hoặc nƣớc (pH 7.0 - 8.5) vào trung tâm màng và ly tâm 1 phút. Để tăng nồng.

14.Cột 1 phút rồi ly tâm trong 1 phút.

15.Kiểm tra sản phẩm tinh sạch bằng điện di trên gel acrylamide hoặc agarose 2.2.5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose:

Dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách đƣợc các đoạn DNA có kìch thƣớc khác nhau (Bảng 10).

Bảng 10: Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tá ch acid Nucleic

Nồng độ gel (%w/v) Dãy kìch thƣớc tách hiệu quả (kb)

0,5 2 – 25 0,7 0,8 – 10 1,2 0,4 – 5 1,5 0,2 – 3 2,0 0,1 – 2 2,5 0,05 – 1,5

Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút. Bản gel sau điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV).

Ðiê ̣n di trên gel polyacrylamide:

Hiệu quả của sự phân tách DNA trong gel phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (Bảng 11), kìch thƣớc và điện tìch của DNA.

Bảng 11: Sự phân tách DNA trong gel polyacrylamide không biến tính

Acrylamide (%w/v) Hiệu quả phân tách (nucleotide)

3,5 1000  2000 5 80  500 8 60  400 12 40  200 15 25  150 20 6  100

Các sản phẩm sau khi đƣợc điện di trên gel acrylamyde nồng độ thìch hợp sẽ đƣợc hiện băng với phƣơng pháp phù hợp có thể đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV) hoặc sử dung phƣơng pháp nhuộm bạc của Bassam (1991) và quan sát kết quả dƣới ánh sáng trắng.

2.2.6. Phƣơng pháp giải trính tự.

Phần lớn các phƣơng pháp nói trên đƣợc sử dụng để sàng lọc bƣớc đầu đột biến điểm/SNPs. Để khẳng định chình xác đột biến hay biển đổi ngƣời ta phải giải trính tự trực tiếp. Nguyên tắc của hầu hết các phƣơng pháp giải trính tự hiện nay đều dựa trên phƣơng pháp enzyme giải trính tự. Với sự phát triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phƣơng pháp này cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao. Để thực hiện đƣợc giải trính tự bằng máy tự động thí các mạch đơn DNA đƣợc tổng hợp trong ống phản ứng giải trính tự phải đƣợc đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser.

là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Phần điệndi polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trƣớc nó.

Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trính điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thí vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ đƣợc con mắt cảm quang ghi nhận và lƣu lại thành một đỉnh cƣờng độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cƣờng độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tƣơng ứng với các màu để cuối cùng phân tìch thành trính tự của đoạn DNA Với các máy thế hệ mới sau này, ngƣời ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trính tự có thể thực hiện đƣợc chỉ trong một ống nghiệm. Phƣơng pháp này cho phép xác định chình xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến nhƣ: loại đột biến, vị trì, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền.

2.2.7. Tình toán thống kê

Xƣ̉ lý các số liê ̣u phân tìch theo các phƣơng pháp thống kê thƣờng dùng . So sánh các đặc trƣng thống kê mẫu bằng phép ki ểm định thống kê 2 với mức ý nghĩa α = 0,05.

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC LÂM SÀNG CỦA CÁC BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRONG NGHIÊN CỨU THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRONG NGHIÊN CỨU

Mẫu mô của các bê ̣nh nhân ung thƣ đ ại trực tràng sử dụng trong nghiên cứu đƣơ ̣c thống kê với các đă ̣c điểm bê ̣nh ho ̣c lâm sàng trong Bảng 12.

Bảng 12: Thống kê mẫu tách chiết DNA củ a bê ̣nh nhân ung thƣ đa ̣i trƣ̣c tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng

Đặc điểm Số lƣợng Tỷ lệ % Tuổi ≤50 15 23,1 >50 50 76,9 Giới tình Nam 31 47,7 Nữ 34 52,3 Vị trì ung thƣ Đại tràng 31 47,7 Trực tràng 32 49,2 Đại trực tràng 2 3,1 Hạch 0 15 23,1 13 19 29,2 >3 31 47,7 Ổ sùi loét ^Có 30 46,2 Không 35 53,8 Loại mô bệnh học khối u

Ung thƣ biểu mô

Từ kết quả trong Bảng 12 cho thấy tính trạng mắc ung thƣ đại trực tràng tập trung nhiều hơn hẳn ở nhóm tuổi trên 50 (76,9%), 100% là ung thƣ biểu mô tuyến. Ung thƣ xảy ra tại trực tràng và đại tràng là tƣơng đối đồng đều với đa số các trƣờng hợp đều có hạch, số hạch tƣờng đối nhiều. Kìch thƣớc và số lƣợng hạch thay đổi theo từng bệnh nhân.

3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRỰC TRÀNG

Sử dụng kit tách chiết DNA QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức). 65 cặp mẫu mô (mẫu u và mẫu lân cận u) của 65 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đã đƣợc tách chiết thu DNA tổng số. Kết quả tách chiết DNA tổng số tƣ̀ các mẫu mô đƣợc minh họa trong (Hình 10).

Hình 10: Hình ảnh điện di DNA t ổng tách chiết từ mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng (điện di trên gel agarose 0.8%, nhuộm ethidium bromide).

G1,3,5:DNA tổng số mẫu mô lân cận u G2,4,6 : DNA tổng số mẫu mô u

Theo Hình 10, các băng DNA tổng số tƣơng đối sáng, gọn chứng tỏ hàm

lƣợng DNA trong mẫu khá cao, ìt bị đứt gãy, đủ điều kiện để tiến hành các thì nghiệm tiếp theo. Do đó, chúng tôi sử dụng các mẫu DNA tổng số đã đƣợc tách chiết thành công để tiến hành các bƣớc nghiên cứu tiếp theo.

3.3. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦA DNA TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR

Để nhận biết khả năng xẩy ra đột biến mất đoạn 4977 bp xảy ra trong hệ gen ty thể, chúng tôi đã áp dụng k ỹ thuật PCR sử dụng đồng thời 4 cặp mồi: mtDNA, 49771, 49772 và ND3 và các thành phần phản ứng nhƣ đã trính bày ở phần phƣơng pháp.

Sử dụng DNA tổng số đã đƣợc tách chiết từ mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng làm khuôn cho phản ƣ́ng PCR . Sử dụng các cặp mồi mtDNA, 4977-1, 4977-2 và ND3 cho lần lƣợt cho các cặp mẫu DNA tổng số đã thu đƣợc. Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,7% và gel acrylamide 8% nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV ở bƣớc sóng 245nm, chúng tôi thu đƣợc các kết quả trong Hình 11, Hình 12. Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR có kìch thƣớc tƣơng ứng với kìch thƣớc mong đợi. Với cặp mồi mtDNA cho ta sản phẩm tƣơng ứng dài 433 bp, Sản phẩm của cặp mồi 4977–2 cho băng có kìch thƣớc tƣơng ứng 381 bp và với cặp mồi ND3 cho sản phẩm có kìch thƣớc 246 bp. Nhƣ vậy, chúng tôi đã thành công trong việc sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen trong vùng trính tự bảo thủ của mtDNA, đoạn gen nằm trong vùng ND3 (chứa đoạn bị mất 4977 bp) của các bản sao mtDNA không bị đột biến mất đoạn và đoạn gen không chứa đoạn bị mất 4977 bp ứng với của các bản sao mtDNA bị mất đoạn .

Hình 11: Ảnh điện di kiểm tra các sản phẩm của phản ứng PCR ở cả mẫu u và lân cận u 1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi mtDNA mô u 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi