THỐNG KÊ MỨC ĐỘ HETEROPLASMY XẢY RA TRONG DNA

các bản sao mtDNA có mang đột biến ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng.  Theo vị trì ung thƣ: trong ung thƣ đại trực tràng, nhận thấy tỷ lệ ung thƣ đại

tràng và ung thƣ thực tràng là xấp xỉ nhau, trƣờng hợp ung thƣ nằm giƣ̃a đ ại tràng và tr ực tràng là rất ít. Dù ở mô u hay mô lân cận u thí tỷ lệ xuất hiện đột biến ở bệnh nhân ung thƣ đại trực trang là rất cao (> 80%) và tỷ lệ đột biến ở mô u là cao hơn (>90%) so với ở mô lân cận u.

Tuy nhiên, khi phân tìch thống kê chúng tôi lại thấy tuy sự khác biệt về tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA giữa nhóm tuổi, giới tình, vị trì ung thƣ, số hạch, ổ sùi loét và phân loại TNM giữa mẫu mô u và mẫu mô lân cận u và tỷ lệ đột biến mất đoạn trong các trƣờng hợp này là rất cao (>70%) nhƣng lại không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

3.7. THỐNG KÊ MỨC ĐỘ HETEROPLASMY XẢY RA TRONG DNA TY THỂ THỂ

Nhƣ đã đề cập ở trên, trong mỗi tế bào có chứa hàng trăm đến hàng nghín bản sao mtDNA, nhƣng không phải tất cả các mtDNA đều bị đột biến, do đó các mtDNA mang đột biến cùng tồn tại với các mtDNA bính thƣờng (kiểu dại) trong

cùng một tế bào và tạo thành trạng thái không đồng nhất trong tế bào heteroplasmy. Thống kê mức độ heteroplasmy xảy ra trong mtDNA của 65 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đƣợc trính bày trong Bảng 15 và Hình 17.

Bảng 15: Thống kê mức độ heteroplasmy xảy ra trong mtDNA

Mẫu mô Có xảy ra hiện tƣợng heteroplasmy

Không xảy ra hiện tƣợng heteroplasmy N=65 Mô u 86.20% 13.80% Mô lân cận u 75.40% 24.60% Tình chung 93.80% 6.20%

Hình 17: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ heteroplasmy xảy ra trong mtDNA

Trong 65 mẫu nghiên cứu, tỷ lệ xuất hiện hiện tƣợng heteroplasmy ở m ẫu mô lân câ ̣n u và m ẫu mô u tƣơng ƣ́ng là 86,20% và 75,40% Tình chung, có 61 mẫu có hiện tƣợng heteroplasmy với tỷ lệ 93,80% Nhƣ vậy, hiện tƣợng heteroplasmy

xảy ra khá phổ biến ở các bệnh nhân đƣợc khảo sát. Hiện tƣợng này đã giải thìch sự xuất hiện đồng thời hai trính tự 381 bp và 246 bp của cùng một mẫu mô trên bản gel điện di. 86.20% 75.40% 93.80% 13.80% 24.60% 6.20% N=65 Mô u Mô lân cận u Tính chung

Tỷ lệ heteroplasmy trong mtDNA của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Có xảy ra hiện tượng heteroplasmy Không xảy ra hiện tượng heteroplasmy

Đột biến mtDNA có liên quan đến nhiều loại bệnh khác nhau của con ngƣời. Trong số các đột biến đƣợc tím th ấy trong mtDNA, đột biến mất đoạn 4977 bp xảy ra khá phổ biến và thu hút đƣợc sự quan tâm của nhiều nhóm nghiên cứu. Đã có một vài nghiên cứu với mục đìch sử dụng đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA trong vai trò chỉ thị sinh học cho một số bệnh liên quan ở ngƣời nhƣ bệnh não, tim, cơ [32]. Bên cạnh đó, đột biến này cũng đƣợc nghiên cứu trong nhiều loại ung thƣ khác nhau nhƣ ung thƣ vú, dạ dày, đại trực tràng, gan, phổi... với mục đìch phân tìch mối liên quan giữa đột biến với quá trính phát triển khối u.

So sánh với kết quả nghiên cứu của Chen và cs về đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đã đƣợc công bố năm 2011 [33], nghiên cứu này đƣợc tiến hành trên 104 mẫu bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, sử dụng phƣơng pháp realtime PCR để phân tìch mất đoạn 4977 bp mtDNA và định lƣợng mtDNA trên cả mẫu mô u và mô lân cận u. Theo số liệu đã đƣợc công bố, trong số 104 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng nghiên cứu, có 20 (19.23%) bệnh nhân có mất đoạn 4977 bp ở mẫu mô u hoặc lân cận u. Cụ thể là có 10 (9.62%) trong tổng số bệnh nhân có mất đoạn ở cả mô u và lân cận u, 7 bệnh nhân (6.73%) có mất đoạn ở mô u và 3 bệnh nhân (2.88 %) có mất đoạn ở mô lân cận u. Tiến hành phân tìch một số đặc điểm lâm sàng và các yếu tố nguy cơ khác của ung thƣ đại trực tràng nhƣ độ tuổi, giới tình, mức độ biệt hóa, tính trạng di căn, giai đoạn ung thƣ, chỉ số khối cơ thể (BMI – Body Mass Index), nhóm nghiên cứu nhận thấy không có mối tƣơng quan đƣợc tím thấy giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA trong các mô u và lận cận u với độ tuổi, tính trạng di căn, chỉ số BMI.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tích mối liên hệ giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Kết quả nghiên cứu chúng tôi thu đƣợc cho thấy tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp là khá cao, trong số 65 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đƣợc khảo sát, có 61 bệnh nhân (93,85%) có đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA đƣợc tím thấy trong mẫu mô u hoặc mô lân cận u. Với một tỷ lệ đột biến rất cao và tỷ lệ đột biến ở mô lân cận u có phần cao hơn so với đột biến ở mô u. Kết quả của nghiên cứu này khác với các kết quả đƣợc nghiên cứu trƣớc đây. Đây có thể là những dữ liệu phân

tƣ̉ có ý nghĩa có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Một nghiên cứu vào năm 2011 cũng đã cho kết quả tƣơng tự, đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA trên bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Nghiên cứu này cho thấy khả năng xảy ra và mức độ xuất hiện của mất đoạn 4977 bp ở các mô thuộc khối u thấp hơn so với các mô lân cận khối u của cùng một bệnh nhân. Để giải thìch cho kết quả này, họ đã đƣa ra giả thuyết về vai trò của mất đoạn 4977 bp trong việc phát triển của ung thƣ đại trực tràng nhƣ sau: trong giai đoạn đầu, các tế bào ung thƣ do ảnh hƣởng của các chất gây ung thƣ hoặc các tổn thƣơng do oxi hóa sẽ xuất hiện các mất đoạn. Các mtDNA bị mất đoạn có điều kiện thuận lợi trong quá trính sao chép tạo bản sao (do kìch thƣớc nhỏ hơn các mtDNA bính thƣờng), Điều này dẫn đến sự tìch lũy các mtDNA mang mất đoạn 4977 bp và đến một mức độ nhất định sẽ tăng cƣờng sự phát triển của khối u, ảnh hƣởng đến trạng thái hoạt động của ty thể. Lúc này, trong tế bào xuất hiện cơ chế điều hòa ngƣợc – một phƣơng thức truyền thông tin từ ty thể đến nhân, thông qua sự thay đổi điện thế màng trong ty thể và nồng độ ion Ca2+ giúp duy trí chức năng chuỗi hô hấp. Kết quả là, so với các mô lân cận khối u thí tỷ lệ các mtDNA có đột biến mất đoạn trong mô ung thƣ thấp hơn [33].

Tuy nhiên, khi sử dụng phép kiểm định thống kê χ2 với mức ý nghĩa α = 0.05 để đánh giá mối liên hệ giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng với các đặc điểm lâm sàng thí cho thấy tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA không phụ thuộc vào các đặc điểm lâm sàng bao gồm nhóm tuổi, giới tình, vị trì ung thƣ, số lƣợng hạch, polyp, ổ sùi loét, phân loại TNM. Có thể do số lƣợng mẫu phân tìch còn hạn chế (n=65) nên để khẳng định đƣợc chình xác các mối liên hệ trên thí cần phải tiếp tục tăng số lƣợng mẫu khảo sát trong các nghiên cƣ́u t iếp theo và s ử dụng các phƣơng pháp định lƣợng mtDNA để xác đi ̣nh đột biến mất đoạn trong mtDNA nhƣ realtime PCR, HPLC, D-HPLC...

KẾT LUẬN

Qua các kết quả thu đƣợc từ việc phân tìch đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:

1. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã khuếch đại thành công các đoa ̣n trình tƣ̣ dài 433 bp (với cặp mồi mtDNA), 381 bp (với cặp mồi 4977–2).

2. Tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp củ a DNA ty thể trong số 65 bê ̣nh nhân đƣơ ̣c phân tích là 98,46%.

3. Đã xác đi ̣nh thấy có hiê ̣n tƣợng không đồng nhất về đô ̣t biến mất đoa ̣n 4977 bp củ a DNA ty thể trong 93,80% số mẫu đƣơ ̣c phân tích.

4. Đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA ty thể không ph ụ thuộc vào các đặc điểm lâm sàng của bê ̣nh nhân, bao gồm nhóm tuổi, giới tình, vị trì ung thƣ, số lƣợng hạch, polyp, ổ sùi loét, phân loại TNM (p > 0,05).

KIẾN NGHỊ

Từ quá trính nghiên cứu thực tế, chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị sau: 1. Tiếp tục phân tìch đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng với số lƣợng mẫu lớn hơn và phân tích mối liên quan với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân.

2. Sử dụng các phƣơng pháp khác nhƣ realtime PCR, D-HPLC, HPLC... để xác định mức đô ̣ không đồng nhất của DNA ty thể về đô ̣t biến mất đoa ̣n 4977 bp.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1. Phan Văn Chi (2006), “Nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc ngýời Việt Nam và ðịnh hýớng ứng dụng”, Viện Công nghệ sinh học.

2. Nguyễn Bá Đức (2009), “Ung thư học đại cương”, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội.

3. PGS. TS. Nguyễn Nhƣ Hiền (2005). “Chương 2. Cấu tạo tế bào của cơ thể, sống Sinh học đại cương” . NXB Đại học quốc gia Hà Nội .

4. Đỗ Ngọc Liên (2009), “Miễn dịch học cơ sở”, Nhà xuất bản đại học quốc gia Hà Nội.

5. Lê Đính Roanh, Nguyễn Văn Chủ (2008), “Bệnh học các khối u”, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh

6. Abnet CC, Huppi K, Carrera A, Armistead D, McKenney K, Hu N, Tang ZZ, Taylor PR, Dawsey SM. (2004). ‟‟Control region mutations and the „common deletion‟ are frequent in the mitochondrial DNA of patients with esophageal squamous cell carcinoma”. BMC Cancer. 2004 Jul 1;4:30. PubMed PMID: 15230979; PubMed Central PMCID: PMC459226.

7. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith AJ, Staden R, Young IG, (1981). ”Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature , 9;290(5806):457-65.

8. Burgart L. J., Zheng J., Shu Q., Strickler J. G., and Shibata D. (2009), “Somatic mitochondrial mutation in gastric cancer”, The American Journal of Pathology, 147 (4), 1105–1111.

9. Cheah PY. (2009), “Recent advances in colorectal cancer genetics and diagnostics”, Critical Reviews in Oncology/Hematology, Jan;69(1), 4445.

10. Chen T, He J, Shen L, Fang H, Nie H, Jin T, Wei X, Xin Y, Jiang Y, Li H, Chen G, Lu J, Bai Y. (2011), “The mitochondrial DNA 4977 bp deletion and its implication in copy number alteration in colorectal cancer”, BioMed Central Medical Genetics, Jan 13;12:8. doi: 10.1186/1471-2350-12-8.

11. Cleveland C H. (2010). “Mutation”, .Encyclopedia of Earth. National Council for Science and the Environment. Washington DC, 290: 457-65.

12. Cavalli LR, Liang BC, (1998). “Mutagenesis, tumorigenicity and apoptosis:are the mitochondria involved” . Mutat Res, Feb 26;398(1-2):19-26.

13. Chatterjee A, Mambo E, Sidransky D, (2006). “Mitochondrial DNA mutations in human cancer”. Oncogene, Aug 7;25(34):4663-74.

14. Czarnecka AM, Golik P, Bartnik E. (2006). Mitochondrial DNA mutations in human neoplasia. J Appl Genet ;47(1):67-78.

15. Clayton DA, (1982). "Replication of animal mitochondrial DNA". J Cell Biol, Apr;28(4):693-705.

16. Dakubo GD, Jakupciak JP, Maragh S, Parr RL. (2010), Analysis of potential cancer biomarkers in mitochondrial DNA. Curr Opin Mol Ther. 2006 Dec;8(6):500-6.

17. Dimauro S, Davidzon G. (2005), “Mitochondrial DNA and disease”, Ann Med;37(3):222-32. Review.

18. Ernster L, Schatz G. ( 1981). "Mitochondria: A historical review". J CellBiol, Dec;91(3 Pt 2):227s-255s.

19. Harbottle A, Birch-Machin MA. (2006), “Realtime PCR analysis of a 3895 bp mitochondrial DNA deletion in nonmelanoma skin cancer and its use as a quantitative marker for sunlight exposure in human skin”, Br J Cancer, Jun 19;94(12):1887-93. Epub 2006 May 23.

20. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. (1988),“Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies”, Nature, 331(6158), 717719.

21. Howe JR, Guillem JG. (1997), “The genetics of colorectal cancer”, Surg Clin North Am, Feb;77(1):175-95.

22. Dai JG, Xiao YB, Min JX, Zhang GQ, Yao K, Zhou RJ. (2006). “Mitochondrial DNA 4977 BP deletion mutations in lung carcinoma”. Indian J Cancer. 2006 Jan-Mar;43(1):20-5.

23. Jakupciak JP, Dakubo GD, Maragh S, Parr RL. (2006), “Analysis of potential cancer biomarkers in mitochondrial DNA”, Curr Opin Mol Ther. 2006 Dec;8(6):500-6.

24. Jakupciak JP, Wang W, Markowitz ME, Ally D, Coble M, Srivastava S, Maitra A, Barker PE, Sidransky D, O'Connell CD. (2005), “Mitochondrial DNA as a Cancer Biomarker”, The Journal of Molecular Diagnostics, 7(2), 258–267. 25. Kanginakudru S, Metta M, Jakati RD, Nagaraju J. (2008). “Genetic evidence

from Indian red jungle fowl corroborates multiple domestication of modern day chicken”. BMC Evol Biol, Jun 10;8:174. doi: 10.1186/1471-2148-8-174.

26. Kulawiec M, Salk JJ, Ericson NG, Wanagat J, Bielas JH. (2010). “Generation, function, and prognostic utility of somatic mitochondrial DNA mutations in

cancer”. Environ Mol Mutagen. 2010 Jun;51(5):427-39. doi:

10.1002/em.20582

27. Keller G, Hartmann A, Mueller J, Höfler H. (2001), “Denaturing High Pressure Liquid Chromatography (DHPLC) for the Analysis of Somatic p53 Mutations”, Lab Invest, Dec;81(12):1735-7.

28. Kwok PY, Chen X. (2003), “Detection of Single Nucleotide Polymorphisms”, Current Issues in Molecular Biology, Apr;5(2):43-60..

29. Kwong KY, Bloom GC, Yang I, Boulware D, Coppola D, Haseman J, Chen E, McGrath A, Makusky AJ, Taylor J, Steiner S, Zhou J, Yeatman TJ, Quackenbush J. (2005), “Synchronous global assessment of gene and protein expression in colorectal cancer progression”, Genomics, Aug;86(2):142-58.

30. Labianca R, Beretta GD, Kildani B, Milesi L, Merlin F, Mosconi S, Pessi MA, Prochilo T, Quadri A, Gatta G, de Braud F, Wils J. (2010), “Colon cancer”,

Crit Rev Oncol Hematol. 2010 May; 74(2):106-33.

31. Lee H.C., Pang C.Y., Hsu H.S., Wei Y.H. (1994), “Differential accumulations of 4977 bp deletion in mitochondrial DNA of various tissues in human ageing”,

Biochim Biophys Acta. 1994 Apr 12;1226(1):37-43.

32. Lee-Jun C. Wong, D. S. (1997). “Direct detection of multiple point mutations in mitochondrial DNA”. Clinical Chemistry 43(10) , 1857-1861.

33. Lu J., Sharma L.K and Bai Y. (2009), “Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis”, Cell Research, 19(7), 802–815.

34. Meissner C, Bruse P, Mohamed SA, Schulz A, Warnk H, Storm T, Oehmichen M. (2008), “The 4977 bp deletion of mitochondrial DNA in humanskeletal muscle, heart and different areas of the brain: a usefulbiomarker or more?”, Experimental Gerontology, 43(7), 645652.

35. Palmqvist R, Stenling R, Oberg A, Landberg G. (1998), “Expression of Cyclin D1 and retinoblastoma Protein in colorectal Cancer”, European jounal of cancer, 34(10), 15751581.

36. paliaux RK. (2000). Mitochondrial DNA disorders. Eur J Pediatr. Dec;159 Suppl 3:S219-26.

37. Polyak K, Li Y, Zhu H, Lengauer C, Willson JK, Markowitz SD, Trush MA, Kinzler KW, Vogelstein B. (1998), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nature Genetics, Nov;20(3):291-3. 38. Schumacher HR, Szekely IE, Patel SB, Fisher DR. (1973), “Mitochondria: a

clue to oncogenesis ?”, Lancet. 1973 Aug 11;2(7824):327.

39. Sorenson MD, Fleischer RC. (1996). “Multiple independent transpositions of mitochondrial DNA control region sequences to the neucleus”. Proc Natl Acad Sci U S A, Dec 24;93(26):15239-43.

40. Søreide K, Nedrebø BS, Knapp JC, Glomsaker TB, Søreide JA, Kørner H. (2009), “Evolving molecular classification by genomic and proteomic biomarkers in colorectal cancer: Potential implications for the surgical oncologist”, Surg Oncol, Mar;18(1):31-50. doi: 10.1016/j.suronc.2008.06.006. Epub 2008 Jul 30..

41. Tejpar S. (2007), “The use of molecular markers in the diagnosis and treatment of colorectal cancer”, Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2007;21(6):1071-87. 42. Zhu W, Qin W, Sauter ER. (2004), “Largescale mitochondrial DNA deletion

mutations and nuclear genome instability in human breast cancer”, Cancer delection and prevention, 28(2), 119–26.

43. van Dijk DA, Oostindiër MJ, Kloosterman-Boele WM, Krijnen P, Vasen HF; Hereditary Tumor Study Group of the Comprehensive Cancer Centre West. (2007), “Family history is neglected in the work-up of patients with colorectal cancer: a quality assessment using cancer registry data”, Familial Cancer, 6(1), pp. 131-4.

Tài liệu Web

44. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 45. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/colon/Patient 46. http://ipedia.net/what+is+chemokine 47. http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/ 48. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 49. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 50. http://mitomap.org/bin/view.pl/MITOMAP/DeletionsSingle 51. http://ghr.nlm.nih.gov/chromosome/MT 52. http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/mtdna 53. http://www.medicinenet.com/mitochondrial_disease/article.htm

54. http://www.mitoaction.org/mito-faq

55. http://www.sciencemag.org/content/283/5407

56. http://www.fbi.gov/about-us/lab/biometric-analysis/mtdna