TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR
Để nhận biết khả năng xẩy ra đột biến mất đoạn 4977 bp xảy ra trong hệ gen ty thể, chúng tôi đã áp dụng k ỹ thuật PCR sử dụng đồng thời 4 cặp mồi: mtDNA, 49771, 49772 và ND3 và các thành phần phản ứng nhƣ đã trính bày ở phần phƣơng pháp.
Sử dụng DNA tổng số đã đƣợc tách chiết từ mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng làm khuôn cho phản ƣ́ng PCR . Sử dụng các cặp mồi mtDNA, 4977-1, 4977-2 và ND3 cho lần lƣợt cho các cặp mẫu DNA tổng số đã thu đƣợc. Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,7% và gel acrylamide 8% nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV ở bƣớc sóng 245nm, chúng tôi thu đƣợc các kết quả trong Hình 11, Hình 12. Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR có kìch thƣớc tƣơng ứng với kìch thƣớc mong đợi. Với cặp mồi mtDNA cho ta sản phẩm tƣơng ứng dài 433 bp, Sản phẩm của cặp mồi 4977–2 cho băng có kìch thƣớc tƣơng ứng 381 bp và với cặp mồi ND3 cho sản phẩm có kìch thƣớc 246 bp. Nhƣ vậy, chúng tôi đã thành công trong việc sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen trong vùng trính tự bảo thủ của mtDNA, đoạn gen nằm trong vùng ND3 (chứa đoạn bị mất 4977 bp) của các bản sao mtDNA không bị đột biến mất đoạn và đoạn gen không chứa đoạn bị mất 4977 bp ứng với của các bản sao mtDNA bị mất đoạn .
Hình 11: Ảnh điện di kiểm tra các sản phẩm của phản ứng PCR ở cả mẫu u và lân cận u 1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi mtDNA mô u 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi
mtDNA mô lân cân u
3: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi
4977–2 mô u
4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi
4977–2 mô lân cân u
5: Thang chuẩn 100bp fermentas
6: Thang chuẩn 250bp Biolab
7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ND3
mô u
8:Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ND3
mô lân cân u
Hình 12: Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR có đối chứng âm
1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi
mtDNA mẫu mô u
2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi
mtDNA mẫu mô lân cận u
3: Đối chứng () cặp mồi mtDNA
4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–
2 mẫu mô u
5: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–
2 mẫu mô lân cận u
6: Đối chứng () cặp mồi 4977–2 7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ND3 mô u 8: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ND3 mô lân cận u 9: Đối chứng () cặp mồi 10398
Hính ảnh điện di cho thấy băng sáng, rõ nét, không xuất hiện băng phụ với kìch thƣớc sản phẩm của phản ứng PCR nhƣ mong đợi. Mặt khác, ở trên cùng một đối tƣợng bệnh nhân mà cho cả sản phẩm PCR đột biến mất đoạn 4977-2 và cho cả sản phẩm ND3 chứng tỏ mtDNA có cả bản sao đột biến mất đoạn và cả bản sao không xuất hiện đột biến mất đoạn.
Hơn nữa, để kiểm tra chất lƣợng sản phẩm PCR thu đƣợc trƣớc khi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành làm đối chứng âm, sử dụng nƣớc tinh khiết thay cho DNA tổng số đối với cặp mồi mtDNA, 4977-2 và ND3. Kết quả trong Hình 12 cho thấy các giếng đối chứng âm không xuất hiện băng, chứng tỏ mẫu PCR không bị nhiễm DNA lạ. Sản phẩm PCR thu đƣợc có kìch thƣớc mong đợi, các băng sáng, rõ nét và không xuất hiện băng phụ chứng rỏ không có hiện tƣợng bắt cặp không đặc hiệu. Mặt khác, chúng ta nhận thấy đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA có thể xuất hiện ở cả mẫu mô u và lân cận u hay chỉ xuất hiện ở mô u hoặc mô lân cận u mà không xuất hiện ở loại mô còn lại. Và cũng có trƣờng hợp đột biến không xẩy ra ở cả mô u và mô lân cận u.
Hình 13: Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trường hợp có đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA
Giếng 1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cân u Giếng 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u
Giếng 1,2: Trƣờng hợp đột biến mất đoạn 4977-2 xuất hiện ở cả ở mô u và lân cận của cùng một bệnh nhân
Giếng 3: Đối chứng âm của cặp mồi 4977-2 Giếng 4: Thang chuẩn 100bp của fermentas
Giếng 5: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cận u Giếng 6: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u
Giếng 5, 6: Trƣờng hợp đột biến mất đoạn 4977-2 chỉ xuất hiện ở mô lân cận u mà không xuất hiện ở mô u của cùng một bệnh nhân.
Giếng 7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cân u Giếng 8: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u
Giếng7, 8 : Trƣờng hợp đột biến mất đoạn 4977-2 chỉ xuất hiện ở mô u mà không xuất hiện ở mô lân cận u của cùng một bệnh nhân.
Kết quả điện di (Hình 13) đã cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc có kìch thƣớc mong đợi, các băng sáng, rõ nét, không xuất hiện băng phụ. Đột biến 4977-2 có thể xẩy ra với các mức độ biểu hiện khác nhau, có thể xuất hiện ở cả 2 loại mô (mô u và mô lân cận u) nhƣng cũng có thể chỉ xuất hiện ở mô lân cận u nhƣ trƣờng hợp bệnh nhân ở giếng số 5, 6. Ngƣợc lại, có trƣờng hợp đột biến chỉ xuất hiện ở mô u (trƣờng hợp bệnh nhân ở giếng 7, 8).